Способ определения гликозаминогликанов в жидких средах

 

Изобретение относится к биологической химии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа и сокращение времени анализа. Измеряют флюоресценцию раствора 4,6-днамидино-2-фенилиндола. Добавляют исследуемую пробу. Измеряют флюоресценцию смеси после каждого добавления пробы. При рН 5,6-6,0 регистрируют снижение интенсивности флюоресценции, по которому рассчитывают общее содержание гликозаминогликанов. При рН 2,0 регистрируют повышение интенсивности флюоресценции, по которому рассчитывают содержание гепарансульфата. 7 табл. в 1(Л с ел «ч ел

СОЮЗ СО8ЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А3

„„Я0„„) 257И (so 4 С 01 М 33/48

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3799248/28-14

{22) 08. 10.84 (46) 15.09.86. Бюл. У 34 (71) Институт медицинской генетики

АИН СССР (72) К.Д. Краснопольская, О.Н.Одинокова и С.П.Фещенка (53) 543.854,7(088,8) (56) Bitter Т., Muir Н.М. А modified

uronic acid carbasole reaCtion. Anal.

Biochem. 1962, к- 4, р.330-334.

Grossgebauer К., Kupper D. Interaction between 0NA-binding fluorochromes and mucopolysaccharides in

agarose diffusion fest. Klin Wochenschr,, 1981, ч. 59, N- 18, р. 10651066. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАИИНОГЛИКАНОВ В ЖИДКИХ СРЕДАХ (57) Изобретение относится к биологической химии. Цель изобретения — повышение чувствительности способа и сокращение времени анализа. Измеряют флюоресценцию раствора 4,6-диамидино-2-фенилиндола. Добавляют исследуемую пробу. Измеряют флюоресценцию смеси после каждого добавления пробы, При рН 5,6-6,0 регистрируют снижение интенсивности флюоресценции, по которому рассчитывают общее содержание гликозаминогликанов. При рН 2,0 регистрируют повышение интенсивности флюоресценции, по которому рассчитывают содержание гепарансульфата.

7 табл.

1257519

Таблица 1

Объем мочи, вносимой в кювету с

ДАФИ, мкл

F/F

1,00

0,89

0,82

0,79

15.т ца, F/F, tg g, (1-t

Концентрация ГАГ( мл/мг

j0ti) . 10,0

0,97

0,94

0,90.

150

15 (0,2) = 5,0

0,93

0,86

74

0,79 (0,3) = З,з

0,90

Изобретение относится к биологической химии, а именно к количественному определению гликоэаминогликанов, и может быть использовано в лабораторно-клинических и экспериментальных исследованиях.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа и сокращение времени анализа за счет измерения интенсивности флюоресценции раствора

4,6-диамидино-2-фенилиндола при добавлении исследуемых проб при определенных значениях рИ.

Способ осуществляется следующим образом. 15

Измеряют флюоресценцию раствора

4, 6-диамидино-2-фенилиндола (ДАФИ), затем добавляют исследуемую пробу и измеряют флюоресценцию смеси после каждого добавления пробы. При рН 20

5,6-6,0 регистрируют снижение интенсивности флюоресценции, по которому рассчитывают общее содержание гликозаминогликанов (ГАГ), при рН 2,0 регистрируют повышение интенсивности флюоресценции, по которому рассчигывают содержание гепарансульфата (ГС).

Пример 1. Определение суммарного содержания ГАГ в моче.

Для определения берут О, 1 мл от- 30 диализованной в течение ночи мочи и 2 мп водного раствора ДАФИ в конФ центрации 5 ° 16 M с рН 5,6.

В кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см вносят 2 мл водного раствора ДАФИ и измеряют на спектрофлюориметре при длине волны

450 нм (длина волны возбуждения

355 нм) интенсивность флюоресиенции.

Уровень флюоресценции водного раствора ДАФИ Fö выставляют на шкале прибора как 100Х (см. табл. 1) . Затем микрошприцем в кювету вносят

5 мкл тестируемого образца мочи и снова определяют интенсивность флюоресценции F. Процедуру внесения 5 мкл того же образца мочи с последующей регистрацией F повторяют еще дважды.

Результаты измерения изображают графически на масштабной бумаге в координатах F/F и объем мочи. По графику определяют тангенс угла наклона М начальной части кривой к оси ординат, который равен значению, отсекаемому касательной к кривой на оси абсцисс.

Аналогично строят калибровочную кривую для стандартных растворов хондроитинсульфата в координатах: величина, обратная концентрации ГЛГ, (мл/мг), tg Ы (табл. 2).

Таблица 2

1257519

Продолжение табл.2

3 (4

0,80

0,70

50 (0,4) = 2,5

0,86

0,72

0,68

36 (0,5) = 2,0

0,83

0,65

Таблица 3

F/F

1,00

0,94

0,88

0,85

Затем по калибровочной кривой находят соответствующую определенному .. тангенсу угла наклона обратную концентрацию ГАГ. Концентрацию ГАГ в образ це мочи рассчитывают по формуле

25 (ГАГ)

1 (rAr)

При тангенсе угла et,, равном в данном случае 44, обратная концентрация

ГАГ составляет 2,9 мл/мг ° Концентрацию ГАГ в данном образце рассчитывают следующим образом:

1 (ГАГ) = †--- — — = 0,345 мг/мл.

2,9 мл/мг

Пример 2. Определение суммар- 35 ного содержания ГАГ в растворе протеогликанов.

Для определения берут О,t мл водного раствора протеогликана в концентрации 0,2 мг/мл и 2 мл водного 40 раствора ДАФИ в концентрации 5 10 М с рН 6 О.

В кварцевую кювету вносят 2 мл водного раствора ДАФИ и исходный уровень флюоресценции Р выставляют 45 на шкале прибора как 100%. Затем в кювету с раствором ДАФИ вносят микрошприцем 5 мкл раствора протеогликана, содержащего ГАГ, и определяют интенсивность флюоресценции 50 (табл. 3) . Процедуру внесения 5 мкл раствора протеогликана с последующей регистрациейинтенсивности флюоресценции повторяют еще дважды. Результа- ты, приведенные в табл. 3 изобража- 55 ют графически на масштабной бумаге в координатах F/F — объем раствора протеогликана, Затем определяют по касательной к кривой тачгенс угла наклона кривой к оси ординат (tg<6 ), и по калибровочной кривой определяют концентрацию ГАГ в водном растворе протеогликана.

Объем раствора, вносимого в кювету, мкл

Для данного образца tg Ы .составил

84. Это соответствует по калибровочной кривой обратной концентрации ГАГ

5,56 мл/мг. (ГАГ)

5,56 мг/мл

= 0,18 мг/мл, т.е. в исследованном препарате протеогликана (концентрация 0,2 мг/мл) содержание ГАГ состав. ляет 90Z (О, 18 мг/мл).

П р и и е р 3. Определение суммарного содержания ГАГ в амниотической жидкости.

Для определения берут О, 1 мл отдиализованной в течение ночи амнистической жидкости и 2 мл водного ра-6 створа ДАФИ в концентрации 5 10 М с рН 5 8.

В кварцевую кювету вносят 2 мл водного раствора ДАФИ и исходный

1257519

Таблица 6

Концентрация ГС (мг/мл) 0,2

7,2

0,3

10,8

14,4

0,4

Таблица 4

0,5

18,0

0,6

0,7

21,6

25,2

1,00

28,8

0,8

0,95

0,89

0,84

20

0,81

Таблица 7

Объем раствора, мкл, вносимый в кювету лица 5 0

100

Объем мочи, вносимый в кювету, мкл

F Р=Р— Р

109

100

20

108 уровень флюоресценции Р выставляют на шкале прибора как 100%. Затем в кювету с раствором ДЛФИ вносят микрошлрицем по 5 мкл тестируемого образца амниотнческой жидкости и оп" ределяют интенсивность флюоресценции (табл. 4), Результаты измерения изображают графически на масштабной бумаге в координатах Р/Г " объем амниотической жидкости, определяют тан- !О генс угла наклона начальной части кривой к оси ординат (tg K), и по калибровочной кривой определяют концентрацию ГАГ в амниотической жидкости.. 15

Объем раствора, вносимого в кювету, мкл

При тангенсе угла Ы, равном для данного образца 95, обратная концентрация ГАГ составляет 6,3 мл/мг.

1 (ГАГ) = — — — - — — = 0,159 мг/мл 35

6,3 мл(мг

Пример 4. Определение концентрации гепарансульфата в смеси ГАГ в моче.

Для определения берут О, 1 мл мочи 40

-6 (диализ не обязателен) и 2 мл 5 10 М раствора ДАФИ в 0,01 H Н SO< рН 2,0, В кювету с раствором ДАФИ вносят

20 мкл тестируемого образца мочи и определяют уровень флюоресценции 45

Г ° Флюоресценция свободного красителя Р- выставляется за 100%. Результаты измерения приведены в табл. 5.

Затем строят калибровочную кривую для стандартных растворов ГС в координатах 5,F (концентрация ГС в мг/мл) (табл.6).

- Поскольку суммарная концентрация

ГАГ в том же образце мочи составила

0,345 мг/мл (пример -1), а концентрация ГС при ЬР, равном 8, составила

0,225 мг/мл, процентное -содержание

ГС в смеси ГАГ составляет 65,2%.

Пример 5. Определение концентрации ГС в смеси стандартов ГАГ в растворе.

Для определения .берут 2 мл 5 ° 10 И раствора ДАФИ в 0,01 Н Н ЯО4 рН 2,0 и 0,1 мл тестируемой смеси ГАГ, содержащей по 0,25 мг/мл ГС и хондроитинсульфата.

Порядок проведения титрования во времени такой же, как в примере 4.

Результаты определения приведены в табл. 7.

По калибровочной кривой (табл. 6), находят концентрацию ГС,соответствующую значению Р, равному 9 — 0,25 мгlмл.

Составитель Л. Шилина

Техред Л.Олейник Ко ректор О. 31yr пвая

Редактор А. Долинич

4910/4 i Тираж 778 ПодписHoc

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ

Производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул.Пр<. ектная, 4

7 12575

Формула изобретения

Способ определения гликозаминогликанов в жидких средах путем обработки их 4,6-диамидино-2-фенилиндолом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и сокращения времени анализа, к раствору 4,6-диамидино-2-фенилиндо19 8 ла добавляют исследуемую среду с пос" ледующим измерением изменения интенсивности флюоресценции,причем при рН

5,6-6,0 определяют суммарное содержание гликозаминогликанов по сниже» нию интенсивности флюоресценции, а при рН 2,0 определяют содержание гепарансульфата по повышению интенсивности флюоресценции.