Способ определения липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови

 

Изобретение относится к способу и реактивудля определения липопротеинов низкой плотности (ЛНП), целью является ускорение способа. Б исследуемые пробы сыворотки крови добавляют антитело - липопротеин высокой плотности (ЛВП), образующуюся нерастворимую часть отделяют и в надосадочной жидкости определяют ЛНП :ш1и его компоненты обычными, для этой цели методами. ЛНП - антитела согласно изобретению используют в форме ЛВПантисыворотки , в виде обезжиренной ЛВП- антисыворотки, либо в форме очищенных фракций ЛВП-антител. Также применяют фрагменты ЛВП-антител, например Fab-, Fabj - и Fab -фрагменты , взятые в концентрации 10- 10 моль/л. Отделение образовавшихся при добавке ЛВП-антител иммуноагрегатов осуществляют обычными способами . Если используют растворимые ЛВП-антитела, то отделение осуществляют путем центрифугирования. Если используют иммобилизованные, связанные с носителем ЛВП-антитела, то иммуноагрегаты отделяют путем простого отделения жидкой фазы от компактной твердой фазы. В качестве иммуногенов, однако, предпочтительно применяют полностью очищенную ЛВП-фракцию. Очистку ведут путем выделения в ультрацентрифуге. В зависимости от условий дополнительно проводят дальнейшую очистку через иммобилизованный конкавалин А по методам аффинной хроматографии или электрофореза . Антисьшоротку получают путем иммунизации овец или кроликов, 3 табл. СО с ю со О5 о со ы

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

{я) 4 G 01 N 33/53 описания изоврктениЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3585413/28-14 (22) 22.04.83 (31) Р 3215310 ° 4 (32) 23.04.82 (33) DE (46) 07.03.87. Бюл. Ф 9 (71) Берингер Маннхайм ГМБХ (DE) (72) Й. Цигенхорн (DE), 3. Шифер (AT), Б. Дрэгер (ЭЕ) (53) 612.015(088.8) (56) Патент ФРГ Ф 2600664, кл. С 01 И 33/92, 1977. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ

НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ (ЛНП) В СЬБОРОТКЕ

КРОВИ (57) Изобретение относится к способу и реактиву- для определения липопротеинов низкой плотности (ЛНП), целью является ускорение способа. В исследуемые пробы сыворотки крови добавляют антитело — липопротеин высокой плотности (ЛВП), образующуюся нерастворимую часть отделяют и в надосадочной жидкости определяют ЛНП ,или его компоненты обычными для этой цели методами, ЛНП вЂ” антитела согласно изобретению используют в форме ЛВП.,Я0 „„1296019 А 3 антисыворотки, в виде обезжиренной ЛВПантисыворотки, либо в форме очищенных фракций ЛВП-антител. Также применяют фрагменты ЛВП-антител, например Fab-, Fab — и Fab -фрагмен2

-7 ты, взятые в концентрации 10

- з

10 моль/л. Отделение образовавшихся при добавке ЛВП-антител иммуноагрегатов осуществляют обычными способами. Если используют растворимые

ЛВП-антитела, то отделение осуществляют путем центрифугирования. Если используют иммобилизованные, связанные с носителем ЛВП-антитела, то иммуноагрегаты отделяют путем простого отделения жидкой фазы от компактной твердой фазы. В качестве иммуногенов, однако, предпочтительно применяют полностью очищенную ЛВП-фракцию. Очистку ведут путем выделения в ультрацентрифуге. В зависимости от условий дополнительно проводят дальнейшую очистку через иммобилизованный конкавалин А по методам аффинной хроматографии или электрофореза. Антисыворотку получают путем иммунизации овец или кроликов. 3 табл.

1 12960

Изобретение относится к способу и реактиву для,определения липопротеинов низкой плотности (ЛНП) °

Цель изобретения — ускорение способа.

Гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия благоприятствуют возникновению атеросклероза и инфаркта сердца. Определение холестерина и триглицеридов в сыворотке (крови) поэ- Щ тому относится к наиболее часто осуществляемому тесту в клинико-химической обычной лаборатории.

Способ осуществляют следующим образом. l5

В исследуемые пробы добавляют антитело — липопротеин высокой плотности (ЛВП), образующуюся нерастворимую часть отделяют и в надосадочной жид.- кости определяют ЛНП или его компо- 20 ненты.

Установлено, что ЛВП-антитела все без исключения осаждают мешающие определению ЛНП липопротеиновые фракции наряду с самим ЛВП, в особенности ЛОНП и хиломикроны, однако, ЛНП

I не осаждается. Как ЛНП, так и ЛВП, ЛОНП и хиломикроны содержат долю протеина, которая в свою очередь содержит одинаковые апопротеины, также в З0 очень различных концентрациях. Антитела к ЛВП количественно осаждают не только ЛВП, но также ЛОНП и хиломикроны, не влияя при этом на ЛНП.

Осаждение ЛОНП и хиломикронов мож- З5 но ускорять использованием дополнительно известных осадителей для этих веществ.

Остающуюся в надосадочной жидкости реактива ЛНП вЂ” фракцию затем 40 определяют по обычным для этой цели методам. Связанный холестерин, содержащийся в ней, определяют при применении известных для этой цели способов. Так, например. определяют путем 45 омыпения с помощью спиртового раствора гидроксица калия и химического определения по Liebermann-Burchard. Однако предпочтительно осуществляют ферментативное определе- 50 ние при использовании холестериноксидазы и расщепляющего холестерин фермента или системы ферментов, как, в особенности, холестеринэстераза.При применении последнего метода опреде- 55 ляют потребленный кислород, образовавшийся холестенон или предпочтительно в большинстве случаен обра."зовавшийся Ндй по известному для

19 2 этой цели методу Фахманна. Предлагаемым способом путем удаления фракций ЛОНП и хиломикронов предотвращают появление помутнений, которые мешают оптическому измерению количества холестенона или Н О в рамках

2 2 цветных реакций. Поэтому способ пригоден в сочетании с колориметрическими методами определения холестерина.

Кроме того, вместо содержащегося в ЛНП-фракции холестерина или других ЛНП-компонентов, таких как аполипопротеин В, фосфолипиды и триглипериды, определяют ЛНП-фракцию, используя нефелинометрическое определение или турбидиметрическое определение, ЛНП-антитела согласно изобретению используют либо в форме ЛВП-антисыворотки, в виде обезжиренной ЛВПантисыворотки, либо в форме очищенных фракций ЛВП-антител. Также применяют фрагменты ЛВП-антител, например

Ф

Fab-, Fabz — и Fab -фрагменты, или антитела к аполипопротеинам А, С и/или Е ЛВП или его фрагменты, или моноклональные ЛВП-антитела.

Получение используемых антител осущесч вляют с применением чистого

ЛВП или одного из указанных аполипопротеинов в качестве иммуногенов.

Для получения антител используют кроликов и овец. Кроме упомянутых животных, соответственно сравнимых живых существ, применяют также культуры клеток.

Отделение образовавшихся при добавке ЛВП-антител иммуноагрегатов осуществляют обычными способами.

Если используют растворимые ЛВП-антитела, то отделение осуществляют путем центрифугирования. Если используют иммобилизованные, связанные с носителем ЛВП-антитела, то иммуноагрегаты отделяют путем простого отделения жидкой фазы от компактной твердой фазы, например твердых тел, покрытых антителами. Если применяют полученные с помощью аполипопротеинов в качестве иммуногена антитела, то используют их,когда применяемый в качестве иммуногена полипопротеин имеет липидную оболочку. Для этого после обычного удаления липидов (делипидирования) и последующего фракционирования аполипопротеинов выбранный аполипопротеин фракции А, С

3 12960 и/или Е снова повторно липидируют (релипидируют).

В качестве иммуногенов предпочтительно применять полностью очищенную ЛВП-фракцию. Очистку ведут пу- 5 тем выделения в ультрацентрифуге. В зависимости от условий дополнительно проводят дальнейшую очистку через иммобилизованный конкавалин А по методам аффинной хроматографии или электрофореза.

Пример 1. А. Получение очищенной ЛВП. После отделения ЛОНП и .ЛНП в ультрацентрифуге выделяется 15 узко отобранная ЛВП-фракция (d=1 080,1,210) (U,Ð, Skipski Lipid composition of Lipoproteins in normal and

diseased states, b: Blood Lipids and

Таблица 1. Введение

День

0-й

Внутрикожно

7-й

То же

Внутримьппечно

14-й

Подкожно

30-й

Внутримышечно

60-й

Подкожно

Все следующие

30 дней

45 стых эфиров жирных спиртов, 400 ед/л холестеринэстеразы, 250 ед/л холестериноксидазы и 200 ед/л пероксидазы.

После инкубирования в течение

20 мин при комнатной температуре измеряют экстинкцию пробы по сравнению с холостым значением реактива, (холостое значение реактива содержит 50 мкл антисыворотки и учитыва- ет содержание холестерина в сыворот55 аЕ = ьЕ„„ -аЕ холостое значение реактива ЛНП-холестерина (мг/дл)

1,385 х сЕ.

В табл. 2 приведены результаты.

Первое взятие пробы крови осуществляют спустя 45 дн.

В, 50 мкл сыворотки смешивают с

150 мкл приготовленной по и. Б анти сыворотки. После инкубации в течение

30 мин при комнатной температуре отделяют центрифугированием образовавшийся осадок (2 мин при 10 000 д).

50 мкл прозрачной надосадочной жидкости смешивают с 2 мл реактива, который содержит О, 1 моль/л трис-буфера, рН 7,7, 0,05 моль/л аппарата магния, 1 ммоль/л 4-аминофеназона, 6 ммоль/л фенола, 4 ммоль/л 3,4 -дихлорфенола, 0,3% полигликолевых проLipoproteins Quantitation, Composition and Metabolism. Hrsg: Nelson, Mileyt Нью-йорк, 1972, с. 471-583).

Затем еще дважды седиментируют, соответственно, флотируют фракцию при плотностях 1,080 и 1,210. ЛНПфракция очищается с помощью аффинной хроматографии через иммобилизованный коякавалин A(Febs. Lett 1974, 91, 174-198) или посредством GeonPevi соп-В1лоск-электрофореза электрофоретически согласно R.W. MahIey, К.S. Holcombe (1977), J.Lipid. Res

18, 314-324.

Б. Получение антисыворотки. Вид животных: овцы или кролики.

При применении полученного по п.А иммуногена используют схему иммунизации, приведенную в табл, 1.

1 мг протеина (ЛВП), эмульгированного в Freund Adjuvans

1296019

Т а б л и ц а 2

l Сыворотка Внешний вид

ЛНП-холестерин, мг/дл

Холестерин, мг/дл

Триглицериды, мг/дл

NIH-способ

Иммунологическое осаждение

238

503

214

353

Мутный

591

495

638

510

Прозрачный

237

231

350

Прозрачный

Мутный

102

195

575

Содержит хиломикроны

149

130

231

379

Содержание холестерина в пробе

Проба

До осаждения После осаждения

61, 4.

2,6

Хиломикр оны

23,2

2,8

ЛОНП

165,0

177,0

ЛНП

0,,0

50,9

ЛВП

BHHHIIH Заказ 631/64 Тираж 777 Подписное

Произв,-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

В качестве стандартного метода служит NIH — способ (после отделения

ЛОНП и хиломикронов в ультрацентрифуге осаждается ЛНП). Из разницы между величиной холестерина до и после осаждения получают значения для ЛНПхолестерина.

Матша1 of laboratory ОрегаС ons, Lipid Research Clinics Program, Ь рЫ30

and Lipoprotein Analysis, DHE4 Publication N 65-628.

Формула изобретения

Способ определения липопротеинов 50 низкой плотности (ЛНП) в сыворотке крови путем осаждения примесей осаждающим агентом с последующим определением содержания ЛНП в надосадочной жидкости, отличающийся 55 тем, что, с целью ускорения способа, Пример 2. Раствор по 50 мкл с

ЛОНП, ЛВП, ЛНП соответственно хиломикронов смешивают со 150 мкл антисыворотки кроликов, которая получена, с помощью ЛВП в качестве иммуногена.

После центрифугирования в надосадочной жидкости определяют содержание холестерина как описано в при— мере 1.

В табл. 3 приведены результаты.

Та бли.ца 3 в качестве осаждающего агента используют очищенную фракцию антител к ли-, нопротеидам высокой плотности (ЛВП) нли антисыворотку к ЛВП, фрагменты антител ЛВП или обезжиренную ЛВП-антисыворотку, взятые в концентрации

-7 -3

10 -10 моль/л, и определяют холестерин, фосфолипиды и триглицериды.