Способ определения катехоламинов в биологическом материале

 

Изобретение предназначено для исследования физических и химических свойств биологических веществ и для экспериментальных и клинических ис- . следований обнаружения и количественного определения биологически активных соединений - адреналина, норадре-- налина и дофамина. Цель изобретенияускорение и повьппение точности анализа путем снижения потерь катехоламинов в процессе обработки биологического материала. Для этого навеску ткани (100-250 мг) перетирают на холоду () в стеклянном гомогенизаторе в растворе О,1 н. хлорной кислоты, центрифугируют (4000g, 15 мин). Супернатант сливают, осадок вновь гомогенизируют , перемешивают с такой же

СО1ОЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3668995/28-14 (22) 02.12.89 (46) 07.04.87. Бюл. У 13 (71) Горьковский государственный медицинский институт им. С.М.Кирова (72) Ю.А.Богдарин, Г.А.Бояринов, А.С.Гордецов, А.И.Матюшин, И.И.Стукалина, В.В.Перешеин и Е.К.Павлова (53) 612.015(088,8) (56) Journal of Chromatography, 1980, ч. 190, р. 347-357. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение предназначено для исследования физических и химических свойств биологических веществ и для экспериментальных и клинических исследований обнаружения и количественного огределения биологически активных соединений — адреналина, норадре-. налина и дофамина. Цель изобретения— ускорение и повьппение точности анализа путем снижения потерь катехоламинов в процессе обработки биологического материала. Для этого навеску ткани (100-250 мг) перетирают на холоду (4 С) в стеклянном гомогенизатоЛ0» 1302194 А 1 ре в растворе 0,1 н. хлорной кислоты, центрифугируют (4000g, 15 мин). Супернатант сливают, осадок вновь гомогенизируют, перемешивают с такой же (5 мл) порцией О,I н. хлорной кислоты и обрабатывают с помощью ультразвукового дезинтегратора (150 Вт, амплитуда 10 мкм) 2 мин. После повторного центрифугирования (4000g, 15 мин) супернатанты объединяют, смешивают с окисью алюминия (О 5 г) в стеклянном стакане (на 20 мл) при о

4 С. Смесь переносят на бумажный фильтр, вакуумным отсосом кислоту удаляют, осадок промывают, высушивают под вакуумом, вносят вместе с фильтром в пробирку с гексаметилдисилазаном (1,5 мп) так, чтобы уровень последнего был вьппе уровня окиси алюминия, добавляют 10-20 кг сульфата аммония, кипятят с обратным холодильником, реакционную смесь перегоняют под вакуумом, упаривают до 50 мкл при 160-170 С,:проводят газовую хроматографию с ионизационно-пламенным детектором. Ошибка способа не превышает 37.

1 1302194 2

Изобретение относится к исследованию химических и физических свойств биологических веществ и может быть использовано в экспериментальных и клинических исследованиях для обнаружения и количественного определения биологически активных соединений— адреналина, норадреналина и дофамина.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности анализа за счет снижения потерь катехоламинов в процессе обработки биологического материала.

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску ткани 100-250 мг перетирают на холоду (4 С) в стеклянном гомогенизаторе в растворе 0,1 н. хлорной кислоты объемом 5 мл, центрифугируют (4000 об/мин, 15 мин). Супернатант сливают, осадок вновь гомагенизируют, перемешивают с новой порцией 0,1 н. хлорной кислоты (5 мл) и подвергают обработке с помощью ультразвукового дезинтегратора (150 Вт, амплитуда 10 мкм) в течение 2 мин. После повторного центрифугирования (4000 об/мин, 15 мин) супернатанты объединяют, смешивают с окисью алюминия (О 5 r) в стеклянном стакане (на о

20 мл) при 4 С и перемешивают в течение 30 мин. Смесь переносят на бумажный фильтр, помещенный на стеклянном фильтре Шотта, с помощью вакуумного отсоса кислоту удаляют, осадок промывают дистиллированной водой (1015 мл), высушивают под вакуумом, вносят вместе с бумажным фильтром в пробирку с гексаметилдисилазаном (1,5 мл) таким образом, чтобы уровень гексаметилдисилазана был выше уровня окиси алюминия, добавляют сульфат аммония (10-20 мг), кипятят 15-30 мин с обратным холодильником при 130-160 С, реакционную смесь перегоняют под вао куумом при 140-.150 С и упаривают при

160-170 до 50 мкл, после чего проо водят газовую хроматографию с иони— зационно-пламенным детектором на трехметровой стеклянной колонке с внутренним диаметром 3 мм, заполненной хроматоном (0,125-0,160 мм} + 5%

Е-30 при температуре испарителя

230 С и термостата колонок 210 îÑ.

Пример 1. Навеску надпочечников собаки 150 мг перетирают на холоду (4 С) в стеклянном гомогенизаторе в растворе 0,1 н. хлорной кислоты (5 мл), затем центрифугируют

15 мин при 4000 об/мин. Супернатант сливают, осадок вновь центрифугируют, перемешивают с новой порцией кислоты (5 мл) и подвергают обработке с помощью ультразвукового дезинтегратора (150 Вт, амплитуда 10 мк) в течение

2 мин. После повторного центрифугирования (15 мин при 4000 об/мин) супернатант переносят к первой порции кислоты. Объединенную смесь кислот смешивают с окисью алюминия (О 5 г) при о

Э

4 С и перемешивают в течение 30 мин стеклянной лопаткой или миксером при

100 об/мин. Окись алюминия с кислотой количественно переносят на бумажный фильтр Шотта. С помощью вакуумного отсоса кислоту удаляют, а окись промывают дистиллированной водой (1015 мл). Высушенный под вакуумом порошок окиси алюминия вместе с бумажным фильтром переносят в пробирку с гексаметилдисилазаном (1,5 мп) и 15 мг сульфата аммония (катализатор), затем кипятят с обратным холодильником о при 145 С в течение 25 мин. По истечении этого времени проводят вакуумную перегонку при 145 С. Полученную жидкость упаривают до 50 мкл при о

165 С и провоцят хроматографический анализ в стандартных условиях.

Пример 2. Навеску надпочечников собаки в количестве 150 -мг перетирают при 4 С в стеклянном гомоге35 жлзаторе в 5 мл 0.,1 н. раствора хлорной кислоты и проводят операции как в примере 1 до этапа кипячения гексаметилдисилазана с катехоламинами, сорбированными на окиси алюминия. Затем условия меняют следующим образом.

Смесь кипятят с обратным холодильником при 130 С 15 мин. По истечении этого времени проводят вакуумную перегонку при 140 С. Полученную жидкость упаривают при )60 С до 50 мкл и проводят газохроматографический анализ в стандартных условиях.

Пример 3. Навеску надпочечников собаки в количестве 150 мг перео тирают на холоду (4 С) в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл раствора (О,1 н.) хлорной кислоты и проводят операции, как в примере l,цо этапа кипячения гексаметилдисипазана с катехоламинами, сорбированными на окиси алюминия. Затем условия меняют следующим образом.

1302194

Составитель Н. Гуляева

Редактор О. Юрковецкая Техред И.Попович

Корректор Л.Патай

Тираж 777 Подписное

ВНИИПИ Государственного -комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 1212/44

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Смесь кипятят с обратным холодильником при 160 С 30 мин, проводят вакуумную перегонку при 150 С. Полученную жидкость упаривают при 170 С до

50 мкл и проводят газохроматографи- 5 ческий анализ в стандартных условиях.

Ошибка способа не превышает 37..

Формула изобретения®

Способ определения катехоламинов в биологическом материале путем гомогениэации исследуемой пробы в хлорной кислоте, центрифугирования сорбции катехоламинов супернатанта на окиси алюминия, упаривания и получения силиловых эфиров катехоламинов при обработке гексаметилдисилазаном с последующей газовой хроматографией, отличающийся тем, что с целью ускорения и повышения точности анализа за счет снижения потерь катехоламинов в процессе обработки биологического материала, перед нанесением супернатанта на окись алюминия проводят ультразвуковую дезинтеграцию осадка в хлорной кислоте, повторно центрифугируют, супернатанты после первого и второго центрифугирования объединяют, смешивают с окисью алюминия, которую затем высушивают под вакуумом на бумажном фильтре, помещенном на стеклянном фильтре Шотта, и вносят вместе с бумажным фильтром в прббирку с гексаметилдисилазаном таким образом, чтобы уровень гексаметилдисилазана был выше уровня окиси алюминия, добавляют сульфат аммония, выдерживают при 130-160 С в течение

l5-30 мин, затем реакционную смесь перегоняют под вакуумом при 140150 С и упаривают при 160-170 С, после чего проводят гаэовуюхроматографию.