Штамм гриба @ @ вкпм @ -326 - продуцент лимонной кислоты

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба, используемого для производства лимонной кислоты в условиях глубинного культивирования . Селекционированный штамм As- pergillus niger ВКПМ F-326 обладает высокой активностью образования лимонной кислоты при глубинном культивировании на разбавленных и концентрированных мелассных средах, образуя до 9,9 кг/м в 1 сут лимонной кислоты . При этом выход от редуцирующих веществ составляет 88,2%. 4 табл. g (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„,SU„„315472

А1

E 3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ST0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4048980/28-13 .(22) 27.01.86 (46) 07.06.87. Бюл. 11 21 (71) Ленинградский межотраслевой научно-исследовательский институт пищевой промьппленности (72) В.М. Голубцова, В.П. Ермакова, Е.Я. Щербакова и В.М. Финько (53) 663.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 407946, кл. С 12 N 1/1 4, 1972.

Авторское свидетельство СССР

У 975799, кл. С 12 N 15/00, 1980. (59 4 С 12 N 1/14 С 12 Р 7/48//

//(С 12 N 1/14, С 12 R 1:685) (54) HITAMN ГРИБА АБРЕКИ 108 NIGER

ВКПМ F-326 — ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба, используемого для производства лимонной кислоты в условиях. глубинного культивирования. Селекционированный штамм As"

pergillus niger ВКПМ F-326 обладает высокой активностью образования лимонной кислоты при глубинном культивировании на разбавленных и концентрированных мелассных средах, образуя до 9,9 кг/м в 1 сут лимонной кислоты. При этом выход от редуцирующих веществ составляет 88,2Х. 4 табл.

1 13154

Изобретение относится к микробиологической промьпппенности и касается нового штамма гриба вида Aspergillus

niger, продуцирующего лимонную кислоту в условиях глубинного культивирования.

Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего высокой продуцирующей активностью по образованию лимонной кислоты при ферментации на мелассных растворах.

Новый штамм получен в результате селекции с использованием метода генной инженерии: гибридизации путем слияния протопластов, полученных из мицелия двух штаммов Аэрergillus niяег штамма Л-106, культивируемого в производстве лимонной кислоты поверхностным способом, и штамма Л-.4. В результате гибридизации выделен рекомбинатный штамм 91-2 с новыми свойствами, объединяющий в себе генотипы двух промышленных штаммов, дающих потомство, совмещающее свойства родн25 тельских штаммов.

Протопласты получают из !7-часового мицелия, выращенного на минимальной синтетической среде, содержащей, г/л:

Глюкоза 5,0

Дигидроортофосфат калия

Сульфат магния, .гидрат 0,5

Сульфат аммо- 35 ния 0,5

Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)

Пептон 40

Вода

0,5

0,5

2,5

Остальное

В качестве литического фермента применяют смесь дрожжелитина Г!ОХ и лиофилизированного пищеварительного сока виноградной улитки (ПСУ) в

10 мМ фосфат-цитратном буфере. Стабилизатором протопластов служит 0,6 М

КС1. Слияние протопластов осуществляют в 30%-ном растворе полиэтиленгли- g0 коля, содержащем 0Ä01 М СаС1 „ регенерацию слившихся протопластов — на плотной гипертонической минимальной среде. Из 100 огобранных рекомбинатов один — 91-2 синтезирует наибольшее количество лимонной кислоты с высоким выходом от сахара. Для закрепления новых свойств конидии выделенного рекомбината обрабатывают 0„0IX-ным вод72 2 ным раствором 1,4-бис-диазоацетилбуо тана (ДАВ) в течение суток при +4 С.

Из 100 полученных мутантов после изучения их кислотообразующей способности отбирают мутант 9!-2-79 — штамм

Л-5 (Ленинградский-5), имеющий номер

ВКПМ F-326.

Новый штамм обильно образует конидии золотисто-желтого цвета, являющиеся посевным материалом в производстве лимонной кислоты. В 7Х-ном по сахару сусле конидии начинают прорастать через 6 ч.

Штамм является более устойчивым к бактериальной флоре (Е. cali, В.шеsentericus, С. tropicalis и др.), сопутствующей производству лимонной кислоты, по сравнению с проиэводствен. ными штаммами Л-1 и Л-4.

Штамм ВКПМ F-326 является активным продуцентом лимонной кислоты при глубинном культивировании как в услови" ях технологии разбавленных, так и по технологии концентрированных сред.

При культивировании в глубинных условиях на разбавленных меласных средах штамм образует на 8,67 больше лимонной кислоты с I м в сутки. Одновременно снижается удельный расход мелассы на 11,5Х по сравнению с производственным штаммом Л-l.

Морфолого-культуральные признаки.

Диаметр колонии, конидиальных головок, длина конидиеносцев, диаметр конидий у нового штамма приближаются к размерам тех же величин родительского штамма Л-106. Длина стеригм

I u II порядков у штамма близка к другому родительскому штамму — Л-4.

Новый штамм имеет мелкие пузырьки на конидиеносцах.

Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-326 на суслоагаре образует крупную колонию, достигающую на 5-е сутки в диаметре в среднем 8,1 см. Окраска колонии золотисто-желтая. Воздушный мицелий хорошо развит, конидиеношение обильное. В центре конидиальные головки расположены плотно, несколько возвьппаются над остальными. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе

0,4 см светлая аконидиальная зона.

Обратная сторона колонии гладкая, белая.

На 5-е. сутки на среде Чапека вырастает колония диаметром 5,7 см.

Окраска колонии золотисто-желтая.

13!54

В центре колонии конидиальные головки крупные, расположены несколько плотнее, чем по остальному газону роста. К краю колонии величина конидиальных головок уменьшается, нарастающий край в радиусе 0,4 см покрывают незрелые. мелкие конидиальные головки. Обратная сторона колонии гладкая, белая.

Признаки нового штамма представлены в табл. l.

Морфологические свойства у пятисуточных культур, выращенных при

32 С на суслоагаре, следующие: конидиальные головки круглой формы, диаметр их сечения 74-169 мкм, средний диаметр головок 119 мкм. Вздутие конидиеносца (пузырь) шаровидной формы диаметром от 22х20 до 62х80 мкм, сред- 20 ний диаметр Збх34 мкм. Стеригмы двуслойные, длина стеригм первого порядка 5,3-25,3 мкм, в среднем 14,8.

Стеригмы второго порядка длиной 4,0х х9,3 мкм, в среднем 6,0 мкм. Конидии круглые с толстой желтой оболочкой.

Средний диаметр конидий 3,75 мкм.

Конидиеносцы прямые, бесцветные,дли. на конидиеносцев 400-2000 мкм, ширина 8-25 мкм. 30

Образование лимонной кислоты у нового штамма изучено при различных режимах ведения процесса: в лабораторных опытах в глубинных условиях выращивания на мелассных 35 средах с содержанием сахара 30 г/л (табл. 2); в лабораторных опытах в глубинных условиях на мелассных средах с содержанием сахара 130 г/л (табл. 3); в производственных циклах в цехе глубинной ферментации по производству лимонной кислоты на мелассных средах с исходной концентрацией сахара 30 г/л по технологии ферментации отъемно-.доливным способом (табл. 4).

Результаты испытаний предяагаемого штамма по сравнению с известными

;П-1 и Л-4 представлены в табл. 2-4.

Из таблиц следует, что штамм Л-5 является более активным кислотообразователем при всех испытанных режимах по сравнению с производственными 55 штаммами.

Пример 1. Процесс ферментации осуществляют в глубинных условиях на качалке типа АВУ-50 р с числом

0,16

Среду, приготовленную для ферментации, разливают в колбы по 50 мп и вносят в них по 10 ип подрощенного мицелия .

В процессе ферментации проводят подливы мелассного раствора, содержащего 250 г/л сахара, по следующей схеме: первый подлив через 24 ч ферментации в количестве 10 мл, второй подлив через 30 ч ферментации в ко4 качаний 160 в мин в колбах емкостью

700 см при 32 С.

Опыты проводят на образце мелассы, имеющей следующую характеристику: сахароза 46Х, СаО 1,31Х, рН 6,3.

Для подращивания мицелия готовят мелассный раствор, содержащий 30 г/л сахара. Состав среды для подращивания, г/л:

Меласса 65,1

Карбонат натрия 0,087

Гексацианоферроат калия, гидрат 0,261

Оксалат аммония, гидрат (для полноro осаждения

СаО) 2,16

Дигидроортофос-. фат калия

Сульфат магния, гидрат 0,25

Сульфат цинка, гидрат 0 005 рН 6,8-7, 2

Вода До I л

Для ферментации готовят мелассную

"среду, содержащую 30 г/л сахара (указанная среда для подращивания мицелия), но без добавления сульфата магния ° Состав среды для подлива следующий, г/л:

Меласса 543,4

Гексацианоферроат калия, гидрат 2,355

Вода До1л

Для приготовления споровой суспеиэии 0,1 г спор Aspergillus niger замачивают в 10 мл мелассного раствора, приготовленного для подращивания мио целия, в течение 1 ч при 32 С. Приготовленный для ферментации мелассный раствор разливают в колбы по 50 мп и засевают 10 мл споровой суспензии.

В этой среде споры подращивают 24 ч.

Подрощенный мицелий служит посевным материалом для засева ферментируемой среды.

1315472

0,25

Для ферментации используют мелассную среду, содержащую, г/и:

Меласса 283

Карбонат натрия 0,38

Гексацианоферроат калия, гидрат 1,128

Оксалат аммония, гидрат (для выведения 1/2 солей кальция в пересчете на

СаО) 4,7

Дигидроортофосфат калия 0,16 личестве 9 мл, а затем по 4 мл через

5, 6 и 7-е сутки ферментации. Процесс ведут 9 сут.

В качестве контроля используют производственные штаммы Л-4 и Л-l.

Результаты испытаний, представленные в табл. 2, показывают, что у селекционированного штамма возрастает массовая доля лимонной кислоть1 в составе синтезируемых кислот °

Съем лимонной кислоты у нового штамма возрастает на 11,8% по сравнению со штаммом Л-1 и на 6,3Х по сравнению со штаммом Л-4.

У нового штамма соответственно увеличивается выход лимонной кислоты от сахара на 11,9% по сравнению со штаммом Л-1 и на 6,4% по сравнению со штаммом Л-4.

Пример 2. Условия проведения те же, что и в примере I. Подращивание мицелия проводят на мелассных средах, содержащих 50 г/л сахара; на ферментацию используют мелассные среды с содержанием сахара

130 г/л.

Для подращивания используют мелассную среду, содержащую, г/л:

Меласса 109

Карбонат натрия 0,145

Гексацианоферроат калия, гидрат 0,436

Оксалат аммония, гидрат (для полного осаждения

СаО) 3,63

Сульфат магния, гидрат

Дигидроортофосфат калия 0,16

Сульфат цинка, гидрат 0,005 рН 6,8

Вода До lл

Испытания показали, что на концентрированных мелассных средах с содержанием .сахара 130 г/л полученный штамм увеличивает съем лимонной кислоты на 12,5% по сравнению со штам" мом Л-1 и на 7,9% по сравнению со штаммом Л-4. Кроме того, селекциони40 рованный штамм увеличивает выход лимонной кислоты от сахара на 12,1Х по сравнению со штаммом Л-1 и на

7,7Х по сравнению со штаммом Л-4, культивируемыми в.тех же условиях.

45 П р и M e p 3 Выращивание кис

5

Сульфат цинка, гидрат 0,005 рН 6,0

Вода До l л

Для приготовления споровой суспензии О,1 г спор Aspergillus niger замачивают в 10 мл мелассного раствора, содержащего 50 г/л сахара и приготовленного по прописи для подращивания мицелия, в течение 1 ч при о

32 С. Приготовленный мелассный раствор для подращивания, содержащий

50 г/л сахара, разливают в колбы по

50 мл и засевают 10 мл споровой суспенэии. В этой среде споры выращивают

24 ч. Подрощенный мицелий служит посевным материалом для засева ферментационной среды.

Ферментационную среду с содержанием сахара 130 г/л разливают в колбы по 50 мл и вносят в них по 10 мл подрощенного мицелия. Весь процесс ферментации протекает на исходном растворе беэ дополнительных дробных доливов питательной среды и заканчи= вается через 5 сут (табл. 3).

Контролем служат варианты опытов, в которых процесс фериентации осуще;ствляют в тех же условиях, но воэбудителями процесса являются производ:ственные штаммы Л-1 и Л-4 (табл. 3). лотообраэующего мицелия нового штамма и синтез лимонной кислоты осуществляют глубинным способом на разбавленной по сахару мелассной среде в производственных условиях.

На замачивание конидий„ подращивание посевного материала, ферментацию и доливы используют мелассный раствор, приготовленный из одной и той же мелассы с отработанным для нее режимом приготовления сред.

При ведении процесса с использованием штамма ВКПИ Р-326 на разбавленной среде подращивание осуществля72 таблица 1

Длина стеригм, мхм

Диаметр комиций > мкм

Длина ко- Диаметр нидиенос- конидица,мкм еносца, мкм

Диаметр

fl I> 9»>1>» ка хоДиаметр конндн- альных аска Диаметр цдмт колонии, 2 во- II noнидиеносца, мкм голорядка рядка вок, мкм

I32 50х50 ЭЗО-1320 It-20 10,4

Векевая 87

6,3

4,1

Л (Ив ,не стив>й) t 19 ЗЭх35 400-2000 !2,4 14,8

3,75

6 ° О

Л-S Золотис- 57 (81001 Р-326) то-келтая

90 44х36 418-1265 9-20 13,3

6,5

4,I

Светло- 81 бевевая

ЧЕриая 52>ЭТО>6 12Н 2 47х4 360-2000 20i2 9,4tOe4 8,3В0,4 3,6+О, I (T a 8 a a ® à 2 нио кои

Л-5 (8ЕЛМ 3>-326) 9,0 6 13 93 4 6,6 . 0

9,55

Л-\ (контроль) 5,12 9,48 IOO 53,6 100

Л-4 (контроль) 9 ° 0 5 ° 85 92>2 7>8 0

1 >

9,55

7 13154 ют в 5 м -ферментаторах с 3 мЭ мелас9 сной среды с содержанием сахара

30 г/л. Через 24 ч подрощенный мицелий в объеме 3 м переводят в фер- . ментатор, содержащий 27 м мелассно- ° 5 го раствора с конценграцией сахара .30 г/л. Через 24 ч ферментации начинают подлив мелассного раствора, содержащего 180 г/л сахара, по м через каждые 1,5 ч. !

О

На 5-е сутки ферментации проводят. отъем ферментированного раствора в количестве 5 м . После отъема в фер3

3 ментатор вводят 5 и мелассного раст вора, содержащего 180 г/л сахара .

Процесс ферментации заканчивается через 7 сут, в контрольном опь1те— через 8 сут. В качестве продуцента в.контрольном цикле, проведенном по 20 тому же режиму ферментации, используют производственный штамм Л-1.При таком ведении процесса у нового штамма массовая доля лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот в среднем 25 из четырех опытов составляет 86,73Х.

Съем лимонной кислоты с 1 м в сутки

>, 9,55 9>0 5,53 92,7 7>34 О

9,9 кг, удельный расход 46Х-ной мелассы на 1 т лимонной кислоты—

2466 кг, выход лимонной кислоты от сахара — 88,16Х (табл. 3). У производственного штамма Л-1 массовая да ля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот составляет 86,14Х, съем лимонной кислоты с 1 м9 в сутки — 8,64 кг, удельный расход 46Хной мелассы на 1 т лимонной кислоты — 2697 кг, выход лимонной кислоты от сахара — 80,6Х (табл..3).

Таким образом, новый штамм в условиях производства образует на

11,5Х больше лимонной кислоты с 1 м в сутки и дает -экономию мелассы на

8,6Х по сравнению с производственным штаммом Л-1. Кроме того, штамм Л-5 эа менее продолжительный (7 сут) цикл быстрее, чем штамм Л-1 накапливает то же количество лимонной кислоты.

Формула изобретения

Штамм гриба Aspergillus niger

ВКПИ F-326 — продуцент лимонной кислоты.

5 ° 72 10,6 111>8 60 !11 9 106 ° 4

5,39 10,0 105,5 56,4 — 100

1315472

Таблица 3 итона- ))асса

ыход лимонной кислоты т хатраяанного сахара нам лимонной ислотт7

Нассозал доля кисл

Х к контДОЛЮ

2 к коитДОЛЮ

Лав ная

Глюконоаая исл ты с олб

Л-S (ЭИЗФ 3261

3,972 l 3, 24 1 12,5 $6, 7 ) 12, I )07,7

7еО ЭеО 4а27 93@0 7вО О

ll" I (контроли) 100,0 50,4 100,0

5>0 3,84 92,0 8,0 0

3;53 11,77

7i0

Л 4 (контроли) 7,0

3,69 !2,30 104,6 52,7 - )00,0

S,0 4,05 91,0 9,0 0

Таблица 4 асход алассы соа р смык а)т люаоил ислоты оиЛ 1

86,14 3,12 )0,74 3700 8,64 )00,0 2697 100 80,6

7,98

Л-S (ВХПН F-326) 7

86 ° 73 7 ° 23 6е04 37!7 9 ° 9 1 1)э5 2466 9)е4 88 ° 2

Проиэводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 олн аст

ННО ой

Составитель 3. Фалунина

Редактор Н. Егорова Техред А.Кравчук Корректор T. Колб

Закаэ 2316/26 . Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 .