Способ получения @ -глобулина,ассоциированного с болезнью крона

 

Изобретение относится к биохимии . Целью является разработка способа получения olg-глобулина, ассоциированного с болезнью Крона. Ткань желудочно-кишечного тракта, пораженную болезнью Крона, гомогенизируют, смешивают с экстрагирующим буфером (трис-глициновый 0,05 М, рН 8,6 с добавлением твин - 80 и тритон Х-100 в концентрации 1 мл на I л буфера) в соотношении 3:1. Экстракт замораживают и размораживают, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин. К надосадку добавляют сульфат аммония до 75% насыщения, инкубируют в течение 12 ч. Взвесь центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин при температуре -4°С. Осадок растворяют в 0,05 М натрийфосфатном буфере рН 7,4 и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют и диализируют против натрийацетатного буфера ,025 с рН4,45 в течение 24 ч, хроматографируют на целлюлозе ДЕАЕ - 52, уравновешивают натрийацетатным буфером /ц 0,025 с рН 4,45.. Элюируют линейным градиентом Хлорида натрия О,25-0,5м, отбирая фракции в диапазоне 0,38-0,46 М хлорида натрия, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в натрийацетатном буфере рН 5,6, изохроматофокусируют на целлюлозе ДЕАЕ - 52 и элюируют 2%-ным раствором амфолинов, рН 6-4 и 4-2,5, отбирают фракцию в диапазоне рН 4,8-5,6 и-лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в натрийфосфатном буфере 0,05 М рН 7,4 и гель - хроматографируют на сефадексе G-150 с отбором фракции с мол,м.85±10 кД. Препарат подвергают конечной доочистке на иммуносорбенте на основе цианбромированной сефарозы 4Б и специфических антител, которые элюируют 0,02 М глицин - НС1 буфером рН 2,2, диализируют и лиофилизируют. а « сл &0 00 со

СО(ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) А1 (50 4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К д ВТОРСНОМ,} СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР . ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3973473/28-14 (22) 18.11.85 (46) 23.06.87. Бюл. Р 23 (71) Научно-исследовательский институт проктологии (72) В.П.Чехонин, И.Л.Халиф, Б.В.Киркин и А.В.Овчинников (53) 6)6.07(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯс(. -ГЛОБУЛИНА, АССОЦИИРОВАННОГО С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА (57) Изобретение относится к биохимии. Целью является разработка способа получения с(. -глобулина, ассоциированного с болезнью Крона. Ткань желудочно-кишечного тракта, пораженную болезнью Крона, гомогенизируют, смешивают с экстрагирующим буфером (трис-глициновый 0,05 М, рН 8,6 с добавлением твин — 80 и тритон Х-100 в концентрации 1 мл на 1 л буфера) в соотношении 3:1, Экстракт замораживают и размораживают, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин. К надосадку добавляют сульфат аммония до 757. насыщения,, инкубируют в течение 12 ч. Взвесь центрифугируют при

15000 об/мин в течение 30 мин при температуре -4 С. Осадок растворяют в 0,05 М натрийфосфатном буфере рН

7,4 и лиофилизируют. Лиофилиэат растворяют и диализируют против натрийацетатного буфера =0,025 с рН 4,45 в течение 24 ч, хроматографируют на целлюлозе ДЕАŠ— 52, уравновешивают натрийацетатным буфером р =0,025 с рН 4,45.. Элюируют линейным градиентом хлорида натрия 0,25-0,5М, отбирая фракции в диапазоне 0,38-0,46 М хлорида натрия, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют.

Лиофилизат растворяют в натрийацетатном буфере рН 5,6, изохроматофокусируют на целлюлозе ДЕАŠ— 52 и элюируют 2Е-ным раствором амфолинов, рН 6-4 и 4-2,5, отбирают фракцию в диапазоне рН 4,8 — 5,6 и лиофилизируют.

Лиофилиза-. растворяют в натрийфосфатном буфере 0,05 М рН 7,4 и гель— хроматографируют на сефадексе G-150 с отбором фракции с мол.м.85+10 кД.

Препарат подвергают конечной доочистке на иммуносорбенте на основе цианбромированной сефарозы 4В и специфических антител, которые элюируют

0,02 M глицин — НС1 буфером рН 2,2, диализируют и лиофилизируют.

1 l3

Изобретение относится к области биохимии, преимущественно к препаративной биохимии, и может быть применено для разработки технологии получения Ы -глобулина толстой кишки,ас— социированного с болезнью Крона (КАГ), 1

Целью изобретения является разработка способа получения о(-гло Z булина, ассоциированного с болезнью

Крона, КАГ является новым, ранее нигде не описанным и не полученным белком и способ его получения является новым и строго специфическим.

Способ осуществляется следующим . образом.

Ткань желудочно-кишечного тракта, пораженную болезнью Крона, тщательно отмывают от сгустков крови в забуференном физиологическом растворе, а затем гомогенизируют в гомогенизаторе "Биомикс" (BHP) .при 10000 об/мин.

Гомогенат смешивают с экстрагирующим буфером (трис-глициновый 0,05 М, рН 8,6 с добавлением твин-80 и тритон Х-100 в концентрации 1 мл на 1л буфера) в соотношении 3:1. Экстракт последовательно трехкратно замораживают и размораживают, а затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение

30 мин. K надосадку прибавляют сульфат аммония до 757. насыщения и инкубируют на магнитной мешалке в течение 12 ч. Взвесь центрифугируют при

15000 об/мин в течение 30 мин при о температуре -4 С. Осадок растворяют в 0,05 M натрийфосфатном буфере рН

7,4 и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в дистиллированной воде и диализуют против натрийацетатного буфера р =0,025 с рН 4,45 в течение

24 ч.Отдиализированный препарат подвергают ионообменной хроматографии на DEAE-52 целлюлозе, уравновешенной натрийацетатным буфером р =0,025 с рН 4,45. Элюцию КАГ проводят линейным градиентом хлорида натрия от

0,25 до 0,5 М, отбирая фракции в диапазоне 0,38-0,46 M хлорида натрия °

Полученный препарат диализуют против дистиллированной воды и лиофилиэируют ° Лиофилизат растворяют в натрийацетатном буфере рН 5,6 и подвергают изохроматофокусированию на целлюлозе DEAE-52 с элюцией 2%-ным раствором амфолинов рН 6-4 и рН 4-2,5 ("LKB",Øâåöèÿ) . При элюции отбирают фракцию в диапазоне рН 4,8-5,6.Фрак18915 2 дят 0,02 М глицин-НС1 буфером рН 2,2.

Конечный препарат диализуют и лиофилизируют.

Анализ полученного препарата показывает высокую степень его очистки (в 2000 раз) с сохранением нативных свойств. Потери препарата при реали20 зации предлагаемого способа не превышают 30Е. Принадлежность белка к

d. -глобулинам показана электрофоре2 тически в полиакриламидном геле.

Интервал элюции КАГ с ионообменного анионообменника определен экспериментально и находится в интервале 0,38 — 0,46 М хлорида натрия. Выбор определенной дискретной точки .из этого интервала (например 0,38

55 цию диализуют против дистиллированной воды в течение 24 ч и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в натрийфосфатном буфере 0,05 M с рН 7,4 и подвергают гель-хроматографии на сефадексе G — 150 с отбором фракции с,мол. м. 85 + 10 кД. Полученный препарат подвергают конечной доочистке на иммуносорбенте, приготовленном на основе цианбромированной сефарозы

4В и специфических антител к КАГ. Элюцию антител с иммуносорбента провоили 0,42, или 0,46) невозможен, так как это приведет к значительным потерям КАГ, который диффузно распределен именно в этой зоне.

Элюция раствором хлорида натрия с молярностью меньше 0,38 М не приводит к отрыву КАГ с анионообменника.

Элюирование раствором хлорида натрия более 0,46 М сопровождается снятием с носителя дополнительных примесей белка, затрудняющих последующую очистку.

Отбор белковой фракции в интервале рН 4,8-5,6 диктуется тем, что изоэлектрическая точка KA1" лежит именно в этом интервале, и в связи с этим ограничение отбора определенной дискретной точки (например: 4,8 или 5,2 или 5,6) сопровождается значительной потерей КАГ. Отбор белковой фракции с изоточками ниже 4,8 и выше 5,6 приводит к тому, что КАГ с носителя не снимается °

Амфалины с рН 6-4 и рН 4-2,5 позволяют создать градиент рН 5,8-3,0, что строго специфично для КАГ.

Пример 1. 50 г ткани толстой кишки, пораженной болезнью Крона, тщательно отмывали от сгустков крови

3 13189 в забуференном физиологическом растворе, а затем гомогенизировали в гомогенизаторе Биомикс" (BHP) при

10000 об/мин. Гомогенат смешивали с экстрагирующим буфером — трис-глициновый 0,05 M рН 8,6 с добавлением твин †80 ) ("МегЕ", ФРГ) и тритон Х- 100 ("Ferrok" ГДР) в концентрации 1 мл на 1 л буфера — в соотношении 3:1.

Экстракт последовательно трехкратно 10 замораживали и размораживали, после чего центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин. К надосадку добавляли сульфат аммония до 75Х. насыщения и инкубировали на магнитной ме- 15 шалке в течение 12 ч. Взвесь центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяли в 0,05M натрийфосфатном буфере рН 7,4 и лиофилизировали. Лиофилизат растворяли 20 в дистиллированной воде и диализовали против натрийацетатного буфера (ионная сила 0,025; рН 4,45) в тече— .ние. 24 ч. Отдиализованный препарат подвергали ионообменной хроматогра- 25 фии на DEAE — 52 целлюлозе ("Watwan", Англия), уравновешанной натрийацетатньм буфером (ионная сила 0,025; рН 4,45). Элюцию КАГ проводили градиентом хлорида натрия от 0,25 до 30

0,5 М с отбором белковой фракции в диапазоне 0,38-0,46 М хлорида натрия. Полученный препарат диализовали против дистиллированной воды и лиофилизировали. Лиофилизат растворяли в натрийацетатном буфере рН 5,6 и подвергали изохроматофокусированию .на целлюлозе DEAE-52 ("Watwan", Англия) с элюцией 27.-ным раствором амфолинов с рН 6-4 и рН 4-2,5 ("LKB", 40

Швеция). При элюции отбирали фракцию в диапазоне рН 4,8-5,6. Фракцию диализовали против дистиллированной воды в течение 24 ч и лиофилизировали.

Лиофилизат растворяли в натрийфос- 45 фатном буфере 0,06 М, рН 7,4 и подвергали гель-хроматографии на сефадексе G†- 150 ("Pharmatia Fine Cemicals", Швеция) с отбором фракции с мол.м. 85+10 кД. Полученный препарат 50 подвергали конечной доочистке на иммуносорбенте, приготовленном на основе цианбромированной сефарозе 4В ("Pharmatia- Fine Cemicals", Швеция) и специфических антител к КАГ. Элю- 55 цию антител с иммуносорбента проводили 0,02 М глицин-НС1 буфером рН 2,2.

Конечный препарат диализовали и лио15 4 филизировали; Реализация предлагаемого способа позволяла получать

672 мкг препарата КАГ с чистотой

98,52.

Пример 2. 50 r ткани толстой кишки, пораженной болезнью Крона, тщательно отмывали от сгустков крови в забуференном физиологическом растворе, а затем гомогенизировали в гомогенизаторе "Биомикс" (BHP) при

10000 об/мин. Гомогенат смешивали с экстрагирующим буфером — трис-глициновый 0,05 М; рН 8,6 с добавлением твин-80 ("Merk"., ФРГ) и тритон X-100 (Ferror, ГДР) в концентрации 1 мл на 1 мл буфера — в соотношении 3:1.

Экстракт последовательно трехкратно замораживали и размораживали, после чего центрифугировали при 15000об/мин в течение 30 мин. К надосадку добавляли сульфат аммония до 75/ насыщения и инкубировали на магнитной мешалке в течение 12 ч. Взвесь центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин.Осадок растворяли в 0,05 M натрийфосфатном буфере рН 7,4 и лио-. филизировали. Лиофилизат растворяли в дистиллированной воде и диализовали против натрийацетатного буфера (ионная сила 0,025; рН 4,45) в течение 24 ч. Отдиалпзованный препарат подвергали ионообмен 1ой хроматографии на DEAE-52 целлюлозе ("Wаtwan", Англия), уравновешенной натр1п1ацетa Tным буфером (ионная сила 0,025;

pI- 4,45) . Элюцию КАГ п7оводи71и 0,46 M раствором хлорида наг-,111, Полученный препарат дпализовали пр;TIIB дистиллированной воды Ii 77iio«>«лизировали.

Лиофи17нзат растворяли B натрийацетатном буфсре рН 5,6 и подвергали изохроматофокусировани1о на целлюлозе

1)ЕАЕ-52 ("11аГ1 ап", Англия) с элюцией

27.-.ным раствором амфо77нпов с рН 6-4 и рН 4--?.5 (" :K3 Ш-=.нпя), П17и э777эции отбирал11 фр;-к,ill в д11апазоне рН

4,8 — 5,6. <77ракц117о, †:.з-..:..вали против

pHCTHJIлн1оовaIiHOII 2 7. ill := Te IeIiIIe 24 и лиофилизировалп, Л11оф11лизаr растворяли в на1ри11фосфатном буфере

0,05 М рН 7,4 и подвер-али :.ель--:zpaматографии и сефадс"1 е G-150 ("Pharmacia Fine Chemicals", Швеция) с отбором фракции с мол,м. 85+10 кД. Полученный препарат подвергалн конечной доочпстке н» 1111м. насорбенте „приготовленном 11а о снопе п11анбромпро ванной сефарозы 48 ("! 11а7тпас7 а Г7. Составитель А.Агуреев

Техред N Xîäàíè÷ Корректор А.Обручар

Редактор Л.Гратилло

Заказ 2504/38 Ти раж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 Раушская наб., д.4/5 Производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул.Проектная,4

5 l3

ne Chemicals", Швеция) и специфических антител к КАГ. Элюцию антител с иммуносорбента проводили 0,02 M гли- цин-HCl буфером рН 2,2. Конечный препарат диалиэовали и лиофилизировали.

Реализация предлагаемого способа позволила получить 672 мкг препарата

КАГ с чистотой 78Х. °

Формула изобретения

Способ получения, о -глобулина, ассоциированного с болезньЮ Крона, включающий гомогенизацию ткани желудочно-кишечного тракта, пораженной болезнью Крона, экстракцию буферным раствором при рН 8,6 с добавлением детергентов, высаливание экс-. тракта, далее полученный осадок растворяют, диализуют, хроматографируют с помощью анионообменного носителя,, 18915 6 при этом проводят элюцию в линейном градиенте хлористого натрия от 0,25 до 0,5 М, отбирают фракции препарата в диапазоне 0,38-0,46 М хлористого натрия и лиофилиэируют их, далее растворенный лиофилизат подвергают изохвоматофокусированию и отбирают фракции в диапазоне рН 4,8-5,6 и лиофилизируют их, растворенный лиофилизат l0 подвергают гель-хроматографии на

С-150 с отбором фракции, имеющей мол.M. 85+10 кД, далее полученную фракцию используют для приготовления антительного иммуносорбента, при

15 этом в качестве сорбента берут цианбромированную сефароэу, далее препарат с мол.м. 85+10 кД подвергают очистке на полученном иммуносорбенте путем элюции его 0,02 М буферным ра20 створом при рН 2,2, элюат диализуют и лиофильно высушивают.