Способ определения кислых гликозидаз в ткани печени

 

Изобретение относится к биохимии , точнее к исследованиям в энзимологии. Цель изобретения - повьпиение точности и сокращение времени анализа путем использования в качестве химического реагента раствора дезоксихолата в 0,5 М гидроокиси натрия в концентрации 0,02-200 мг/мл. Для этого печень интактных самцов кроликов перфузируют на льду ледяным физраствором, очищают от соединительной ткани, гомогенизируют. В качестве источника фермента - обогащенная фракция лизосом, полученная дифференциальным центрифугированием с использованием градиента сахарозы. Затем определяют кислые гликозидазы. В пробы добавляют 0,5 мл цитратного буфера, 0,5 мл 15 мМ раствора субстрата , 0,5 мл фермента, рН буфера 4,0; 4,5; 5,5 для определения /j-ra- лактозидазы, /з-глюкозидазы и g-N- -ацетилглюкозаминидазы соответственно . Субстраты - 4-нитрофенильные производные соответствующих Сахаров. Инкубацию проб ведут при 30 мин. Затем добавляют 2 мл 0,135%-ного раствора дезоксихолата в 0,5 М NaOH, При холостых опытах инкубируют .субстрат и буфер. Фермент вводят сразу после добавления реактива, останавливающего реакцию. Оптическую плотность исследуемых растворов измеряют на спектрофотометре СФ-26 при 400- 410 нм относительно контроля. 2 табл. i 1(Л

C0t03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3907434/28-14 (22) 10.04.85 (46) 30.06.87. Бюл. У 24 (71) Университет Дружбы народов им. Патриса Лумумбы (72) С.П. Сяткин и В.А. Фролов (53) 616.8(088.8) (56) Лизосомы. Методы исследования/

Под ред. Дж. Дингла. M.: Мир, 1980, с. 131-133. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛЫХ ГЛИКОЗИДАЗ В ТКАНИ ПЕЧЕНИ (57) Изобретение относится к биохимии, точнее к исследованиям в энзимологии. Цель изобретения — повышение точности и сокращение времени анализа путем использования в качестве химического реагента раствора дезоксихолата в 0,5 М гидроокиси натрия в концентрации 0,02-200 мг/мл.

Для этого печень интактных самцов кроликов перфузируют на льду ледяным физраствором, очищают от соеди;„,Я0„„1 20750 A I нительной ткани, гомогенизируют. В качестве источника фермента — обогащенная фракция лизосом, полученная дифференциальным центрифугированием с использованием градиента сахарозы.

Затем определяют кислые гликозидазы.

В пробы добавляют 0,5 мл цитратного буфера, 0,5 мл 15 мИ раствора субстрата, 0,5 мл фермента, рН буфера

4,0; 4,5; 5,5 для определения р-галактозидазы, а --глюкозидазы и А-N-ацетилглюкозаминидазы соответственно. Субстраты — 4-нитрофенильные производные соответствующих сахаров.

Инкубацию проб ведут при 37 С 30 мин.

Затем добавляют 2 мл О, 1357-ного раствора дезоксихолата в 0,5 M NaOH.

При холостых опытах инкубируют .субстрат и буфер. Фермент вводят сразу после добавления реактива, останавливающего реакцию. Оптическую плотность исследуемых растворов измеряют на спектрофотометре СФ-26 при 400410 нм относительно контроля. 2 табл.

20750 2 . талов, отнесенному к 1 мг белка. Белок определяют методом Лоури. честве химического реагента раствора дезоксихолата в 0,5 М гидроокиси натрия.

В опытах используют интактных самцов кроликов породы "Шиншилла" массой 2,5-3,5 кг. Печень перфузируют на льду ледяным физраствором, промокают бумажными фильтрами, тщательно очищают от соединительной ткани и взвешивают, Гомогенат готовят из расчета 1:9 (вес ткани на объем среды для гомогенизирования)..Гомогенизацию проводят в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком (зазор 0,2 1 мм) 30 с при 1200 об/мин. В качестве источника фермента используют обогащенную фракцию лизосом, полученную дифференциальным центрифугированием с использованием градиента сахарозы.

Затем проводят определение кислых гликозидаз. В пробы добавляют 0,5 мп буфера, 0,5 мл 15 мМ раствора ñó6страта, 0,5 мл ферментного препарата . Используют 0,2 М цитратный буфер, величина которого равна 4,0; 4,5 и 5,5 для определения р -ãàëàêòoçè дазы, р -ãëþêîçèäàçû и p -N-ацетилглюкозаминидазы соответственно. Субстратами служат 4-нитрофенильные производные соответствующих сахаров. о

Инкубацию проб осуществляют при 37 С в течение 30 мин. Затем добавляют

2 мл О, 135Х-ного раствора дезоксихолата в 0,5 М Na0H ° Холостые опыты ставят, инкубируя только субстрат и буфер. Фермент вводят непосредственно после добавления останавливающего реакцию реактива. Оптическую плотность исследуемых растворов измеряют на спектрофотометре СФ-26 при 405 нм относительно контрольной пробы. Абсолютный выход свободного агликона определяют, сравнивая измеренные в опыте величины экстинкции с калибровочной кривой. Для построения калибровочной зависимости к стандартным растворам агликона добавляют соответствующее методике количество реактива, останавливающего реакцию. 3а единицу активности припимают 1 катал. Удельную активность ферментов выражают числом нка20

50 соответственно, 1 13

Изобретение относится к биохимии, в частности к исследованиям в энзимологии.

Целью изобретения является повышение точности и сокращения времени анализа за счет использования в каПример 1. В опыте используют кроликов-самцов породы Шиншилла" массой 3 кг, Гомогенизацию печени проводят в стеклянном гомогенизаторе

Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком 30 с при 1200 06/мин. В качестве источника фермента используют обогащенную фракцию лизосом, полученную дифференциальным центрифугированием.

Определяют активность кислых гликозидаз. В пробу добавляют 0,5 мг.

15 1буфера, 0,5 мл 15 мМ раствора субстрата и 0 5 мл ферментного препарата.

Используют 0,2 M цитратный буфер, величина рН которого была равна 4,0;

4,5 и 5,5 для определения -галактозидазы, р-гликозидазы и р-N àöåòèëглюкозаминидазы соответственно. Субстратами служат 4-нитрофенильные производные соответствующих сахаров.

Пробы инкубируют при 37 С 30 MHH добавляют 2 мл раствора дезоксихолата в 0,5 M NaOH в концентрации

0,01 мг/мл при концентрации белка в пробе 1 мг/мл, Холостые опыты ставят, инкубируя только субстрат и буфер. Фермент вводят в контрольную пробу непосредственно после добавления останавливающего реакцию реактива. Оптическую плотность исследуемых растворов измеряют на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 405 мм относительно контрольной пробы, За единицу активности принимают 1 катал, Удельную активность ферментов выражают числом нкаталов, отнесенному к

1 мг белка. Белок определяют методом Лоури.

При этом выявлено, что опалесценция в пробах не устраняется и спектрофотометрия таких растворов невозможна .

Пример 2. Определение активности ферментов проводили как в примере 1 но при концентрации раствора дезоксихолата 0,02 мг/мл.

При этом получили прозрачные растворы. Активность p -- галактозидазы,,р-глюкозидазы и р-N àöåòèëãëþêîçàìèíидазы равна 59+1,2; 139<2,4 и 119+2,9

Пример 3. Опрецеление активности ферментов проводили как в примере 1, но при концентрации раствора дезоксихолата 1,0 мг/мл.

13207

Таблица 1

Метод определения

) 2 ) 1 (2 ) 3

Выборочное среднее, х-10 5

139

0,4

0,84

При этом получили активность | — галактозидаэы, р -глюкозидаэы и р-N-ацетилглюкоэаминидазы, равную

58 0,9; 137+1,7 и 121 3,1 соответственно.

Пример 4. Определение активности кислых гликозидаз проводили как в примере 1, но при концентрации раствора дезоксихолата 200 мг/мл.

При этом активность fo --галактози- 10 дазы, р-глюкозидазы и p-N-ацетилглюкозаминидазы была равна 57+2,1, 136 3,2 и 117 3,3 соответственно.

Апробацию метода осуществляли, определяя активность гликозидаз из 15 печени интактных животных; Результаты этой серии опытов суммированы в табл.1.

Значения случайных погрешностей предлагаемого способа оценивали, рассчитывая основные метрологические характеристики m, d, S, E„, и S, являющиеся мерой воспроизводимости, из результатов десяти параллельных определений. Значения удельной активности для всех исследованных: фермен- 25 тов, определенные первым методом (I) был выше, чем вторым (II)..Надежность, точность и воспроизводимость результатов анализа предлагаемым способом выше и лучше в 1,5-2,5 30 раза (особенно для p -N-ацетилглюкозаминидазы), чем при использовании

ТХУ. Ошибка метода менее 0,77, чувствительность равна 0,26 мкМ, Степень рассеивания отдельных измерений око- 35 ло средней низкая, менее 2,57.

Примеры выполнения способа на граничные значения параметров 400-410 нм

Основная метрологическая характеристика

Стандартное отклонение среднего результата,+m .10

Абсолютная воспроизводимость

Среднее отклонение от средне о, d-10- с приведением конкретных данных, подтверждающих достижение цели при этих значениях, приведены в табл, 2. Иэ табл. 2 видно, что в укаэанном диапазоне длин волн от 400 до 410 нм точность измерения максимальна: от 97 до 100X.. Увеличение или уменьшение длины волны приводило к резкому снижению точности определения. Таким образом, измерения количества агликана.в пробе, а следовательно, и активности гликозидаз с максимальной точностью возможны только в указанном диапазоне длин волн. Р аким образом, предлагаемый способ определения гликозидаз обладает высокой чувствительностью, точностью и надежностью определения, отличается простотой и быстротой анализа (время анализа сокращается на .4050 мин).

Формула и з о б р е т е н и я

Способ определения кислых гликозидаз в ткани печени путем гомогениэации пробы инкубации с субстратом с последующим добавлением химического реагента и спектрофотометрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и сокращения времени анализа, в качестве химического реагента используют раствор дезоксихолата в

0,5 M гидроокиси натрия в концентрации 0,02-200 мг/мл, а измерение оп.— тической плотности проводят при длине волны 400-410 нм.

119 t 21 40 93

0 15 0 9 О 62 О 28 1 8

0,66 2,16 1,16 0,82 3 84

1320750 б

Продолжение табл.1

Метод определения

Основная метрологическая характеристика

1 2 3 1 2 3

Вариабельность, со..10-з

2,0

60 40 3,1

10,0

Стандартное отклонение отдельного результата, 8 .10

1,2

2,8 1,7 1,6

5,7

Относительная воспроизводимость

Относительное среднее отклонение, Е„

0,6

1,0

18 10 20

6,1

0,8

2,0 2,4 1,4 4,0

В качестве останавливающего реакцию реактива применяли 0,1353-ный раствор дезоксихолата в 0,5 M NaOH (I) и 3,37. ТХУ (II).

Расчеты статистических показателей проводили на основании результатов десяти параллельных определений активности а-глюкозидазы (1), р-галактозидазы (2) и е-_#_-апетилглюкозаминоксидазы.

Таблица 2

Зависимость коэффициента инструментальной чувствительности фотометрической реакции и точности определения от длины волны.

Длина волны (Л), нм Тангенс угла Точность наклона (S>< ) определения,X

390

2,01

395

400

3,0

405

3,1

100

410

3,05

415

2,7

420

2,5

Относительное стандартное отклонение, S

ЮЮ Ю

ТюФ

II

I 1