Способ выделения и очистки урокиназы из биологических жидкостей

 

Изобретение относится к способам получения очищенных ферментов, а именно урокиназы, и может быть использовано в медицинской промьппленности для получения препаратов урокиназы . Целью изобретения является повышение выхода и удельной активности целевого продукта. Способ предусматривает использование в качестве сорбента при адсорбции фермента пористых кремнеземов или лигнина отмывки сорбента 0,05-0,2 М трис-НС1 буферным раствором рН 8-10 и элюцию фермента 2-4%-ным водным раствором аммиака. Культуральную жидкость, полученную после выращивания перевиваемой культуры клеток почек человека, объемом 5 л и активностью 30 СТА и 1 мл пропускают через колонку см, заполненную пористым стеклом МПС-2000-ВГХ в течение 12 ч. Затем колонку отмывают 500 мл 0,1 М трис-НС буферного раствора рН 10. Урокиназу элюируют из колонки после отмывки, используя в качестве элюента 4%-ный водный раствор аммиака. Скорость элюции 6 мл/мин. Концентрированная и очищенная урокиназа элюируется из колонки вместе с аммиаком в объеме 90 мл и имеет активность 1600 СТА/МЛ. Содержание белка в полученном препарате 0,4 мг/мл. Выход урокиназы составляет 96%,удельная активность 4000 СТЛ/мг. I табл. С ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

COUHAЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (51) 4 С 12 N 9/72

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

У" х; -.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3973496/28-13 (22) 30.10.85 (46) 23.07.87. Бюл. У 27 (71) Научно-исследовательский институт биомедицинской технологии (72) Г.А. Афанасенко, М.В. Зиновьева, И.В. Красильников и А.Л. Пичугин (53) 577.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

1(584034, кл. С 12 N 9/72, 1975. (54) СПОСОБ ВЬ)ДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ УРОКИНАЗЫ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ (57) Изобретение относится к способам получения очищенных ферментов, а именно урокиназы, и может быть использовано в медицинской промьипленности для получения препаратов урокиназы. Целью изобретения является повьппение выхода и удельной активности целевого продукта. Способ предусматривает использование в качестве сорбента при адсорбции фермента пористых кремнеземов или лигнина отмывки сорбента 0,05-0,2 М трис-НС1 буферным раствором рН 8-10 и элюцию фермента

2-4Х-ным водным раствором аммиака.

Культуральную жидкость, полученную после выращивания перевиваемой культуры клеток почек человека, объемом

5 л и активностью 30 СТА и 1 мл пропускают через колонку 4 18 см, заполненную пористым стеклом MIIC-2000-ВГХ в течение 12 ч. Затем колонку отмывают 500 мл 0,1 М трис-НС1 буферного раствора рН 10. Урокиназу элюируют из колонки после отмывки, используя в качестве элюента 47.-ный водный раствор аммиака. Скорость элюции 6 мл/мин.

Концентрированная и очищенная урокиназа элюируется из колонки вместе с аммиаком в объеме 90 мл и имеет активность 1600 СТА/мл. Содержание белка в полученном препарате 0,4 мг/мл.

Выход урокиназы составляет 967,удельная активность 4000 CTA/мг. I табл.

1 13250

Изобретение относится к способам получения очищенных ферментов, а именно урокинаэы, и может быть использовано в медицинской промьппленности для получения препаратов урокинаэы.

Целью изобретения является повышение выхода и удельной активности целевого продукта.

Способ заключается в том, что адсорбцию урокиназы ведут на пористом 1О кремнеземе или лигнине, а удаление балластных белков иэ сорбента осуществляют путем его отмывки трис-НС1 буфером рН 8,0-10,0.

Предлагаемый способ осуществляет- 15 ся следующим образом.

Биологическую жидкость, содержащую урокиназную активность, пропускают через колонку, заполненную пористым стеклом или лигнином. Объем колонки 20 соответствует 0,1-0,01 объема пропус. каемой жидкости. Затем колонку отмывают от примесей, пропуская трис-НС1 буферный раствор, рН 10. Обычно пропускают 2-5 объемов колонки такого 25 буфера. После отмывки колонки адсорбированн;ю урокиназу элюируют 247-ньм водным раствором аммиака, пропуская его со скоростью около

1 см/мин. 30

Урокиназа элюируется узкой зоной, обычно в объеме, равном 0,5 объема колонки, вследствие чего происходит ее концентрирование в десятки раз.

Выход очищенной и концентрированной урокиназы составляет 80-957..

Пример 1. .Выделение урокиназы из культуральной жидкости.

Культуральную жидкость, полученную после выращивания перевиваемой 40 культуры клеток почек человека, объемом 5 л и активностью 30 СТА/мл пропускают через колонку 4 18 см, заполненную пористым стеклом МПС

2000-ВГХ, в течение 12 ч. Затем ко- 45 лонку отмывают 500 мл 0,1 М трис-НС1 буферного раствора, рН 10. Урокинаэу элюируют из колонки после отмывки, используя в качестве элюечта 47-ный водный раствор аммиака. Скорость элю- 50 ции 6 мл/мин., Концентрированная и очищенная урокиназа элюируется из колонки вместе с аммиаком в объеме

90 мл и имеет активность 1600 СТА/мл.

Содержание белка в полученном препа- 55 рате 0,4 мг/мл. Выход урокиназы 967, удельная активность 4000 СТА/мг.

Пример 2, Культуральную жидкость объемом 250 мл и активностью

76 2

1 СТА/мл пропускают через колонку

1 12 см, заполненную силохромом С-80, в течение 2 ч. Затем копонку отмывают

0,05 М трис-НС1 буфером, рН 8 (30 мл).

После отмывки через колонку пропускают 27.-ный раствор аммиака. На выходе аммиака иэ колонки собирают фракцию объемом 4 мл, содержащую концентрированную и очищенную урокиназу, активность фракции 950 СТА/мл. Выход урокиназы 907. Удельная активность препарата 3300 СТА/мг.

Пример 3. Выделение урокинаэы из мочи.

Мочу человека, разбавленную пополам водой, объемом 2,5 л и активностью 9 СТА/мл пропускают через колонку !,5 10 см, заполненную пористым стеклом MIIC — 2000-ВГХ. Отмывку колонки проводят 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 9. Элюцию урокиназы осуществляют раствором аммиака, Получают

7 мл очищенной и концентрированной урокинаэы. Выход урокинаэы 853, удельная активность 2600 СТА/мг.

Пример 4. Выделение урокиназы на лигнине.

Культуральную жидкость.;, полученную после выращивания перевиваемой культуры почки человека, объемом

500 мл и активностью 17 СТА/мл пропускают через колонку, заполненную лигнином (выделенным из хвойных пород деревьев). Объем колонки I 12 см.

Затем колонку отмывают 0,05 М трисНС1 буфером, рН 10 (30 мл). После отмывки через колонку пропускают

47-ный водный раствор аммиака. На выходе аммиака иэ колонки собирают фракцию объемом 4 мл, содержащую концентрированную и очищенную урокиназу. Активность фракции 1250 СТА/мл, содержание белка 0,25 мг/мл. Выход урокинаэы 807, удельная активность препарата 5000 CTA/мг.

Пример 5. Выделение урокиназы проводят согласно примеру 4. Для отмывки колонки используют 0,05 М трис-НС1 буфер, рН 8,0. Элюцию урокинаэы проводят 27-ным водным раствором аммиака. Выход урокиназы 857 удельная активность препарата 4500 СТА/мг.

П р и и е р б. Культуральную жидкость объемом 1 л и активностью

20 СТА/мл пропускают через колонку

l,5 ° 10 см, заполненную макропористым стеклом МПС вЂ 2500 †Х, в течение 4 ч.

Затем колонку промывают 0,2 М трис1325076 4

Таким образом, при рН отмывающего о- буфера вьш!е 10 наблюдается вымывание и- фермента, а при рН ниже 8 содержание примесного белка в препарате повы5

Специфическим элюентом для урокиназы является аммиак. Водным 2-47-ным раствором аммиака удается полностью элюировать адсорбированную на колонк- 10 ке урокиназу, что не удается при ист- пользовании различных буферных растворов. Более высокий процент аммиака для десорбции не желателен, так как т это не повышает выход фермента, а — !5 приводит лишь к повы>!>енной растворимости матрицы сорбецта. — Предлагаемый способ обладает тех—

Способ выделения и очистки урокиназы из биологических жидко>,ей.

55 предусматривающий адсорбцин, >ер,>ента на сорбенте, отмывку сорбента и элюцию урокиназы 2-47.-ным р:>с TI>opo>;tr .

НС1 буферным раствором, рН !0. Урокинаэу элюируют 27.-ным водным раств ром аммиака. Концентрированная урок наза (объем 9 мл ) имеет удельную ак тивность 3080 СТА/мг. Выход урокина эы 987..

Пример 7. 16000 мл свежесоб ранкой мочи человека активностью

13 СТА!мл пропускают через колонку

2,2 20 см, заполненную пористым сте лом МПС 1,150-ЯГХ, в течение ночи. О мывку от балластных белков проводят

0,1 М раствором трис-НС1 буфера, рН 10. Элюцию урокиназы осуществляю

27-ным водным раствором аммиака. По лучают 170 мл бесцеветнof о раств >ра концентрированной очищенной у >к -:!а эы, удельная активность 3900 1.А;мг, выход 967.

Предлагаемый способ позволяет по- 20 лучать в одну стадию с выходом 80-987. препарат урокиназы с удельной активностью до 4500 CTA/мг. Для получения высокоочищенного препарата предусматривается проведение общепринятых хро- 25 матографических операций.

Сорбенты, используемые в предлагаемом способе, обеспечивают достаточно полный выход фермента. Paнее для получения урокиназы эти сорбенты 30 не использовались.

Предлагаемый способ обладает значительными преимуществами перед известными, прежде всего он прост в изготовлении, так как выделение и очи- 35 стка фермента происходит в один этап с использованием одного сорбента.

Очистка обеспечивается отмывкой колонки экспериментально подобранным буферным раствором, после чего очу- 40 ществляется элюция фермента.

Установлено, что урокиназа достаточно прочно связывается с пористыми кремнеземами и лигнином. Вследствие этого, отмывку производят буферными 45 растворами с достаточно высоким рН, что обеспечивает удаление большинства примесных белков. Интервал рН буферных растворов, при которых удаляются примесные белки, но не происхо- 50 дит вымывание фермента, должен находиться в пределах 8-10. Отключение рН в одну или другую сторону не обеспечивает необходимые чистоту и выход препарата.

Влияние рН отмывающего буферного раствора на очистку урокиназы показано в таблице.

ío Io>ичцостью, так как лс гKO осущеcTВИМ ПРИ СТЕРИЛЬНЫХ УСЛс>Е>1>Л.-: 1;;IPOмь>шленных масштабах. Культу;а.>,и; я жидкость и буферные растворы стерильно подаются в колонку, которую -.Ipe> — варительно стерилизун>т и I ef>ìåòè .èруют. Контроль за прс цессс осvllr ствл>>ют с помощью протс>чпогс> спектрос!>отометра. Сорбенты испо>1ьэу>от многократно,они не содержат вредных примесей, пх сорбционные св >йства восСтаи >ЧЛИВаЮтСя ПОСЛЕ ПНО ус-К:I>rfr>l ЧС:— ре колонку 4 -пог рас>вора l:»!иаK c1 °

Кро>!е того, предлагае>!ы.: с.»:собом при 1 пользовании в каче.с> D» сорбе г;> лигнина возможно полу:>атr. nr>enef>аты, обладающие высокой удель>fo . «ктивп >стью ° Это се>язаио с тем, что лпгнин более спец!!фичсэск>. связывает . ся с урокиназой по сравнецпю с пористым кремнеземом.

Предлагаемьп! способ воспроиз лс>ДИМ Е» апаЛИТИЧЕСКО>1 H nr>e>t;>Pат1!ВпоМ

nарпантах, он может np>I> Ir>>7 ься г(>!я получения урокиназ>1 в .;1.>с1 раторплх

H III: pH>rHErcKoIr промеш>лс fr>r o>e Tfr . Биоло— гические показатели полу>е IEI!,>x npo паратов (прг> испольэ с»а>>ип этого способа) свидетельствуют с> 1>oэмс ености их использования дл>1 ">е>сиди>ч1.

Ф о р м у л а и з о б р е т е и и я миака, о т л и ч а ю щ и 1! с я тем, что, с целью повышения выхода и удельной активности целевого продукта, в качестве сорбента испольэуют пористый кремнезем или лигнин, а отПараметры

15

2 3

0,2

0 3

0,2

0,8 0,4 0,5 0,3 0,3

0,1 М трис-НС1.

Составитель И. Привалова

Редактор Н. Гунько Техред Н.Глущенко Корректор Г.Решетник

Заказ 3021/24 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r Ужгород, ул. Проектная, 4

Содержание урокииаэы в отмывающем элюате (9X),X

Содержание белка в конечн. препарате, мг/мл

% 1325076 6 рывку сорбента с одновременныч удалением балластных белков осуществляют

0,05-0,2 M трис-НС1 буфером рН 8,0l0,0.

Показатели при рН отмывающего буфера

8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5