Урокиназа,иммобилизованная на гепарине

 

УРОКИНАЗА,ИШОВИПИЗОВАННАЯ НА ГЕПАРИНЕ, общей формулы ОС-Ш-Ур -, -о он HOgS-O Ш-50зН п где NH - YP - урокиназа, п 27-46, обладакнцая пролонгированной тромболитической активностью и антикоагулирующим действием и характеризующаяся следующими параметрами: Молекулярная масса 70000+9000 Содержание белка 20-30 масД Сохраняемая каталитическая актив70-90% ность . (от исходной) Специфическая I 150000-200000 активность Ш урокиназы (Л lOOOiU гепарина,

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

Молекулярная масса

Содержание белка

Сохраняемая каталитическая активность.

70000+9000

20-30 мас,X

70-90Х (от исходной) Специфическая активность

-О

Кое ° р Н-оптимум

ТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР (2i ) 3551782/28-13

{22) 27.12.82 (46) 07.09.85. Бюл. У. 33 (72) A.В. Максименко, Е.Г. Тищенко, В.П. Торчилин и В.Н. Смирнов (71) Всесоюзный кардиологический научный. центр ANH СССР (53) 577.15(088.8) (56) 1. Патент США Р 4106992, кл. 195-66 В, 1978.

2. Авторское свидетельство СССР

Ф 824053, кл. G 01 N 33/86, 1979. (54)(57) УРОКИНАЗА,ИММОБИЛИЗОВАННАЯ

НА ГЕПАРИНЕ, общей формулы

o=c- н- гр

„„Я0„;, 1137760 A (5ц4 C 12 N 9/72 11/00//

А 61 К 37/48 где NH — Yp — урокиназа, n = --27-46, обладающая пролонгированной тромболитической активностью и антикоагулирующим действием и характеризующаяся следующими параметрами:. 150000-200000 Я

1Н урокиназы

1000 1U гепарина, (9,3-9,94)

«10 N

25-29 с "

7,3 - 8,5

760 о=с — мн — (р

70-90% (от исходной) Специфическая активность

1 1137

Изобретение относится к биооргани= ческой химии, а именно к синтезу биологически активных химических соединений, обладающих тромболитической и антйкоагулирующей активностью, 5

Предлагаемые соединения представляют собой продукт связывания урокина зы с гепарином. Урокиназа, являясь активатором плаэминогена в организме, применяется как тромболитический агент. Гепарин представляет собой антикоагулирующее средство. Обычно вся тромболитическая терапия ведется на фоне гепаринизации.

Известны производные урокиназы, представляющие собой комплекс урокинаэы с гепарином, основанные на их электростатическом взаимодействии, которые получают инкубацией фермента с гепарином (11. В смесях гепарина 20 и урокиназы образуются наибольшие количества производных, представляющих собой урокиназу, электростатически связанную с гепарином.

Получаемые таким способом произ- 25 водные представляют собой урокиназу, электрически связанную с гепарином, Однако стабильность этих производных оказывается сильно зависимой от величин ионной силы и рН раство- З0 ра, что является препятствием для их использования в терапии.

Соотношение активностей компонентов такого комплекса составляет

30000-100000 IU урокиназы на 100 Ш гепарина. Количество гепарина в ком35 плексе (100 IU) недостаточно для проявления значимого эффекта антикоагулянта в организме. Увеличение дозы препарата гепарината урокинаэы

40 приводит к тому, что наряду с увеличением количества гепарина (и следовательно, антикоагулирующей активности) увеличивается и количества связанной с ним урокиназы. Избыток тромболитика вызывает подавление системы свертывания крови.

Таким образом, данный комплекс урокиназы с гепарином не характеризуется сбалансированным соотношением его компонентов, пролонгированной; и повышенной тромболитической актив- ностью.

Целью изобретения является полу- . чение нового препарата - иммобилизо ванной урокиназы, обладающей тромболитической активностью и антикоагулирующим действием.

Цель изобретения достигается за счет свойств иммобилизованной урокиназы общей формулы где NH-Yp — урокиназа, и = 27-46, характеризующейся следующими пара" метрами:

Иолекулярная масса 70000+9000

Содержание белка 20-30 мас.%

Сохраняемая каталитическая активность

150000-200000

IU урокиназы/100 IU гепарина . Km (9,3-9,94)»

«10 "М

К са1. 25-29 с " рН-оптимум 7,3-8 5 и получаемой связыванием урокиназы с гепарином в слабощелочной среде при температуре от 0 до 25 С в течение 2-20 ч. Значения и, как и в молекуле гепарина, составляет 27-46.

Способ осуществляют. следующим образом.

В 0,01-0,1 И фосфатном буфере рН 8,08,5 растворяют гепарин, к которому затем осторожно добавляют избыток карбодиимида. Смесь инкубируют в течение получаса на холоду, а затем к ней добавляют раствор урокиназы и проводят инкубацию еще в течение

2-20 ч при температуре от 4 до 25 C.

После этого полученное производное подвергают очистке диализом в течение 6 ч против дистиллированной воды и лиофилиэируют.

Связывание урокиназы с гепарином происходит через стадию карбодиимидной активации карбоксильных групп гепарина с последующим взаимодействием с аминогруппами фермента (схема 1).

1137760

СООН

-О

o=c — о — с — wa

+Š— МН2

-R N-С-БК, H!1 Н

О=С вЂ” NH — E — О

Полученный продукт представляет собой урокиназу, ковалентно связанную с гепарином. Синтезированные производные водорастворимы, что весьма удобно .для их повседневного 4О клинического использования. На фоне гепарина заметно эффективнее действует фермент-тромболитик. Модификация урокиназы существенно не меняет ее кинетических свойств, не изменя- 45 ется и термостабильность, зато тромболитическое действие приобретает пролонгированный характер. Остаточная каталитическая активность произВодного урокинаэы В физиологических 5О условиях составляет ? 0-90Х от первоначальной активности нативного фермента

Таким образом, преимуществами описываемого препарата следует считать: возрастание тромболитнческой 55 активности предлагаемых соединений (в 1,5 раза). придание ей пролонгированного характера, а также появление у них новых свойств — привитой антикоагулирующей активности.

В результате для медицинской практики предлагается новое вещество— препарат комплесного пролонгированного действия на ферментной основе, Увеличение молекулярной массы синтезированного препарата способствует увеличению срока его действия в кровотоке.

Пример 1. В 4 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 8,3 растворяют

8 мг гепарина, к которому осторожно добавляют на холоду (4 С) 5 мг

1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида и смесь инкубируют при перемешивании в течение 30.мин, Затем к инкубационной смеси добавляют

1 мп раствора урокиназы 50.000 IU/ìë и инкубацию продолжают при 4 0 в течеиие 16 ч. После этого раствор диализуют против дистиллированной воды

l в течение 6.ч и лиофилизируют, В ре1137760 зультате осуществления реакции связывания с гепарином взаимодействует

90Х белка от его исходного количества (nq данным гельфильтрации на се-.

5 фадексе Г-100), при этом фермент сохраняет 90Х эстеразной активности от первоначальной. По термостабильности полученное производное весьма близко к нативному ферменту, извест- 10 ному, своей термостойкостью. Специфическая активность полученного производного 45000 IU/ìë, содержание белка

30 мас.Х.

H p и м е р 2, Процесс осущест- 15 вляют также, как и в примере 1, за исключением того, что реакцию связывания урокиназы с гепарином проводят в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,0.

С гепаринОм связывается 80Х исход- 2р ного белка, при этом фермент сохраняет 78Х эстефазной активности, и по термостабильности не уступает нативной урокинаэе. Специфическая активность полученного производного 25

39000 IU/ìë, содержание белка по весу 267, . Пример 3, Процесс осуществляют так же, как в примере 1, sa исключением того, что реакцию связы- Зо вания урокинаэы с гепарином проводят в 0,01 М фосфатном буфере рН 8,5.

С носителем связывается 857 исходного белка при сохранении 757. исходной эстеразной активности. Специфическая активность 37000 IU/ìë,.ñîäåðжание белка по весу 24Х.

Пример 4, Процесс проводят так же, как и в примере 1, за исключением того, что реакцию связывания урокиназы с гепарином осуществляют в 0,01 M фосфатном буфере рН 8,3 при 25 С в течение 2 ч. В реакцию связывания вступает 85Х белка от исходного, сохраняемая каталитическая 4 эстеразная активность ферментного 4 производного 75Х. Кинетические свойства препарата, его термостабильность близки тем, что и в примере 1. Специфическая активность 38000 IU/ìë, со- О держание белка по весу 257.

Таким образом, из приведенных при- . меров следует, что количество связанного с гепарином фермента меняется в зависимости от рН инкубации. Диапа" зон р 8,0-8,5 является оптимальным для протекания двух реакций: активации карбоксильных групп гепарина карбодиимидом и взаимодействия их с аминогруппами урокинйзы, Именно полученные при таких значениях рН ферментные производные (примеры 1-4) обладают наилучшими свойствами, Tàê, реакция каталитического гидролиза нативной урокиназой метилового эфира ацетилглициллизина осуществляется по схеме активации хода реакции ее субстратом (cxeMa 2) .

vs 1 2

Е+ S- ES= Е+ P э 2 д)1 К 4Ф вЂ” SE+ P

SES

Продукты примеров 1-4 осуществляют катализ этой реакции по той же схеме. При этом модификация урокиназы гепарином существенно не меняет кинетические свойства урокиназы.

В табл. 1 приведены кинетические параметры реакции гидролиза метилового эфира ацетилглициллизина нативной и модифицированной урокиназой при 25 С 0,1 M KC8 и рН 7,8 (оптимум эстеразной активности) .

Таким образом, каталитические свойства модифицированной урокиназы, изученные на реакции гидролиза метилового эфира ацетилглицнллизина, вполне сравнимы с каталитическими свойствами нативной урокиназы.

Тромболитическую активность нативной и модифицированной урокиназы определяли по известной методике(2). с добавлением в раствор буфера

0,33 мг/мл плазминогена человека.

Препараты нативной и модифицированной урокиназы используют в соотношении, обеспечивающем .одинаковую оптическуй плотность при 280 нм. Результаты экспериментов приведены в табл. 2 (рН 7,4, комн. температура) .

tg aL представляет собой отношение прироста оптической плотности раст= вора (в результате деструкции при тромболизисе нерастворимого фибринового сгустка и перехода его фрагментов в раствор) к величине промежутка времени, за который оно произошло, и характеризует скорость процесса тромболизиса.

Представленные в табл. 2 данные показывают, что в результате модификации урокиназы гепарином тромболитическая активность полученного ферТаблица 1

1(2 ) с-1

1041 м

Препарат

Натнвная урокиназа

Продукт примера 1

Продукт примера 2

2,87

1,33

1,33

9 5

7,9

t 35

9,83

8,1

1,31

Продукт примера 3

9,94

8,5

1,30

Продукт примера 4

9,3

1,33

Таблица 2

Препарат, Нативная урокиназа

100

0,20

Продукт примера 1

Продукт примера 2

Продукт примера 4

0,33

165

145

0,29

0,27

135 ментного производного возрастает при.близительйо в 1,5 раза, что является весьма важным для тромболитической терапии.

Антикоагулирующее действие препаратов модифицированной урокиназы изучали на богатой тромбоцитарной плазме кролика. Показано, что после предварительной инкубации препаратов нативной урокинаэы H производных гепарин-урокиназы (100-250 ед/мп, 5-15 мин, 25 С) с богатой тромбоцитарной плазмой кролика не обнаруживается различий в предотвращении агрегации тромбоцитов и реакции высвобождения АТФ из них, индуцируемых тромбином (1 мИ), Это свиде« тельствует о том, что по активности гепарин в связанном с урокинаэой виде не уступает свободному гепарину. Таким образом, ковалентное свя зывание урокиназы с гепарином не ухудшает терапевтических свойств урокиназы и гепарина и позволяет

137760 8 получить препарат комбинированного ,цействия, Получение тромбоЛйтических средств расширенного спектра действия, в

S том числе и производных урокиназы, обладающих тромболитическим и антикоагулирующим действием, позволяет разрабатывать новые, высокоэффективные способы тромболитической терапии, 10 Предлагаемый препарат модифицированной урокиназы отличается не только более высокой тромболитической активностью чем нативная урокиназа, но и пролонгированным действием. Этот

15 препарат дает возможность перейти от струйных методов введения к инъекционным, сскратить продолжительность терапии, уменьшить дозы назначаемых больному лекарств и соответ20 ственно уменьшить риск "лекарственной болезни"., Все зто позволит широко использовать эти препараты для лечения тромбоэмболий, инфаркта миокарда и заболеваний кровеносных сосудов, Скорость лизиса тромба