Способ определения тимидина в биологической пробе

 

Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - упрощение способа. Клетки костного мозга суспендируют , затем центрифугируют. Осадок суспендируют в лизирующей смеси с аденозинтрифосфатом, К лизату клеток костного мозга с тимидинкиназой добавляют реакционную смесь с различным содержанием тимидина и инкубируют . Добавляют в пробы этанол и смесь наносят на хроматографическую бумагу. После промывки бумажные подложки заливают сцинтилляционной смесью и просчитывают радиоактивность. По калибровочному графику определяют концентрацию тимидина в пробе. 1 ил., 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (ll) А1 (51) 4 G 01 N 33 53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4011291/28-14 (22) 13.01.86 (46) 07. 01. 88. Бюл. Ф 1 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины

AMH СССР (72) Т.Б.Казакова, И.А.Вербина и В.А.Шатов (53) 612,015(088.8) (56) Anal. Biochem., 1973, ч. 55, р. 468-478. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИМИДИНА

В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЕ (57) Изобретение относится к биохи.мии. Цель изобретения — упрощение способа. Клетки костного мозга суспендируют, затем центрифугируют. Осадок суспендируют в лизирующей смеси с аденоэинтрифосфатом. К лизату клеток костного мозга с тимидинкиназой добавляют реакционную смесь с различным содержанием тимидина и инкубируют. Добавляют в пробы этанол и смесь наносят на хроматографическую бумагу.

После промывки бума)кные подло)кки заливают сцинтилляционной смесью и просчитывают радиоактивность. По калибровочному графику определяют концентрацию тимидина в пробе. 1 ил., табл.

1364990 2

1r

30

40

50

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в медицине в случаях, когда проводится лечение антиметаболитами нуклеиновых кислот, а также в тех случаях, когда тимидин используют в качестве лечебного средства в антираковой терапии.

Целью изобретения является упрощение способа за счет сокращения количества стадий.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения тимидина в биологической пробе, включающему инкубацию ее со специфическим э белком в присутствии H-тимидина с последующей очисткой полученного продукта и определением тимидина по калибровочной кривой уровня радиоактивности полученного продукта, в качестве специфического белка используют лизат клеток костного мозга, а инкубацию осуществляют в присутствии насыщающей концентрации аденозинтрифосфата, далее полученный продукт очищают хроматографически.

П р е р 1. Получение лизата клеток костного мозга, содержащего тимидинкиназу.

1,1-10 клеток костного мозга из бедренных костей пяти мышей линии

CBA суспендируют в 4 мл физиологического раствора при 4 С ° Осаждают центрифугированием при 2000 об/мин 10 мин на центрифуге ЦЛС-3. Осадок суспендируют в 2 мл холодной лизирующей смеси, содержащей, M: КС1 0,0 1; MgC1

0,002; трис 0,01; аденозинтрифосфат

0,001; меркаптоэтанол 0,01; аминокапроновая кислота 0,05; 0,6 мг/мл ( бычьего сывороточного альбумина;

10 мкМ NaF, и переносят в чистые пластиковые пробирки по 0,5 мл. Клетки разрушают поочередным замораживанием о в жидком азоте и оттаиванием при 37 С в водном термостате. Процедуру повторяют трижды. Полученный лизат просветляют центрифугированием при

16000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант лизата клеток костного мозга, содержащий тимидинкиназу, разливают в чистые пробирки по 0,5 мл и хранят в жидком азоте, Процедура занимает

1,5 ч.

На чертеже показано построение калибровочного графика.

Составление полной реакционной смеси. Для построения калибровочной кривой к 0,1 мл начальной реакционной смеси, содержащей M: трис О, 15; аденозинтрифосфат 0,0 1; MgC1> 0,0 1;

NaF 0,025; меркаптоэтанол 0,01, рН 7, добавляют по 25 мкл водного раствора тимидина различной концентрации (10;

7; 5; 1; 0,5; 0,1 мМ) и по 25 мкл

Н-тимидина (1,87 mCi/ìë; 40,4 мкИ), Составление полной инкубационной смеси. Для составления полной инкубационной смеси к 20 мкл лизата клеток костного мозга, содержащего тимидинкиназу, добавляют по 30 мкл полной реакционной смеси с различным содержанием тимидина. В качестве контроля берут пробу, содержащую 20 мкл лизирующего раствора (вместо клеточного лизата) и 30 мкл полной реакционной смеси.

Инкубация и анализ результатов.

После составления полной инкубационо ной смеси пробы инкубируют при 37 С в течение 15 мин ° Затем реакцию останавливают, добавляя в кажду пробу по 13 мкл этанола. По 50 мкл из каждой пробы наносят на кружки из хроматографической бумаги Whatman AE-81 или ДЕ-81 диаметром 2,2-2,3 см, бумагу подсушивают. Затем бумажные кружки трижды отмывают дистиллированной водой, один раз этанолом и эфиром.

Сухие бумажные подложки переносят во флаконы, заливают по 5 мл сцинтилляционной смеси и просчитывают радиоактивности на счетчике импульсов.

Определение содержания тимидина в плазме крови мыши. Тимидин концентрацией 60 мг/мл вводят внутрибрюшинно

1 иэ расчета 3,0 мг на 1 r веса животного. Через промежутки времени 2 ч

30 мин; 6 ч 30 мин и 12 ч у животного берут кровь из вены, переносят ее в центрифужные пробирки. Сыворотку отделяют центрифугированием при

3000 об/мин в течение 10 мин. Затем составляют полную реакционную и полную инкубационную смеси как описано выше, за исключением того, что при составлении полной реакционной смеси вместо раствора тимидина добавляют по 25 мкл сыворотки, содержащей неизвестное количество тимидина. Инкубацию проб и анализ результатов проводят как описано при построении калибровочной кривой.

Результаты определения содержания тимидина в сыворотке крови представлены в таблице.

15Фо1 мулаизобретения

Время после

Степень фосфорилирования э

Н-тимидина, имп/мин

Содержание тимидина

Способ определения тимидина в биологической пробе путем инкубации со специфическим белком в присутствии

Н-тимидина с последующей очисткой

3 полученного продукта, регистрацией связанного тимидина и расчетом по калибровочной кривой, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упро25 щения способа за счет сокращения числа стадий, в качестве специфического белка используют тимидинкинаэу в лизате клеток костного мозга, а инкубацию проводят в присутствии насы30 щающих концентраций АТФ. инъекции, ч-мин в плазме, мМ

2 — 30

6 - 30

8 287

21 244

7,8

1,7

12 — 00 42 977

0,15

Исходя из полученных значений радиоактивности, используя калиброинп нин гЩ

10 murrudcw (МИ) 0 7 .Т S

Составитель В.Месянжинов

Редактор Н.Гунько Техред Л.Сердюкова Корректор И.Эрдейи

Заказ 6591/37 Тираж 847 Подписное

BHHHHH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэно: ечненно-нониграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 з 1364990 4 данные о влиянии концентрации не- вочную кривую, находят, что содержамеченого тимидина на фосфорилирование ние тимидина в плазме после инъекции э меченого Н-тимидина (калибровочный через указанные промежутки времени график зависимости уровня радиоактив- составляют соответственно 7,8; 1,7;

5 ности полученного продукта от кон- 0 15 мМ. центрации тимидина в пробе, где точ- Из приведенных результатов следуки (О ) соответствуют уровню радио- ет, что полученный калибровочный активности полученного продукта при график позволяет эффективно различать измерении содержания тимидина в сыво- 1О содержание в биологической пробе неротке крови мыши через разные проме- меченного тимидина концентрации жутки времени после введения ей пре- от О, 1 до 1О мМ. Вся процедура измепарата тимидина) представлены на чер- рения тимидина занимает 2,5-3 ч ° теже.