Способ получения полимера,содержащего звенья - о.сн(сн @ ) сн @ со-

 

Изобретение позволяет обеспечить получение полимера, содержащего звенья -О. СН(СНд)СН„СО - с пониженной кристалличностью и хрупкостью. Процесс ферментации продуцирующих поли- -оксимасляную кислоту микроорганизмов в водной питательной среде ведут до полного ассимилирования источника азота и/или фосфора, а затем в ферментационную среду вводят 4 - 100 мас.% ассимилируемого источника углерода, культивирование продолжают до накопления продуцентом 20-70мас.% получаемого полимера. В качестве ассими.пируемого источника углерода используют кислоты: пропионовую или изомасляную, или акриловую, или 3-окснпропионовую, или 3-хлорпропионовую, или 2-оксимасляную или их водорастворимые соли щелочных металлов. Анализ полученных полимеров, выделенных из клеток бактерий, показьшает снижение зоны эндотерм плавления, что указьшает на снижение кристалличности и хрупкости полимера. 2 з.п.ф.,3 табл. (Л Од сл 4: оо

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЭЮЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУбЛИК

А3 (1% (11) ВСЕ " О1(1С : Я

Н ПАТЕНТ,Ф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ. (21) 3359451/28-13 (22) 17.11.81 (31) 8120991 (32) 07.07.81 (33) GB (46) 15.02.88, Бюл. Ф 6 (71) Империал Кемикал Индастриз IIJIC (СВ) (72) Пол Артур Холмс, Стефен Хью Коллинз и Леонард Фредерик Райт (СВ) (53) 577.15(088,8) (56) А.Wallen et al. — Environmental Science and Technology. 8, 1974, р.576-579.

Marchessaulf et al. — "ЕОРАС

Иасго Florence 1980 International

Symposium on Macromoles Preprints, 2(1980), р.272-275, Патент США У 3275610, кл. 260-80. (594 С 12 P 42 С 12 Р 7 42С 12 R 1:05) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРА, СОДКРжАП1КГО ЗВКНЬЯ -О. СН(СН)СН СО(57) Изобретение позволяет обеспечить получение полимера, содержащего звенья -О. СН(СН )СН СΠ— с пониженЭ 2ной кристалличностью и хрупкостью.

Процесс ферментации продуцирующих поли-CI-оксимасляную кислоту микроорганизмов в водной питательной среде ведут до полного ассимилирования источника азота и/или фосфора, а затем в ферментационную среду вводят 4— !

00 мас.Е ассимилируемого источника углерода, культивирование продолжают до накопления продуцентом 20-70мас.Х получаемого полимера. В качестве ассимилируемого источника углерода используют кислоты: пропионовую или изомасляную, или акрнловую, или 3-оксипропионовую или 3 хлорпропноновую или 2-оксимасляную или их водорастворимые соли щелочных металлов. Анализ полученных полимеров, выделенных из клеток бактерий, показывает снижение зоны эндотерм плавления, что указывает на снижение кристалличности и хрупкости полимера. 2 з.п.ф,,3 табл.

1375143

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения термопластичного палиэфира повторяющейся структуры — О. СН(СНЗ)CH СΠ— (1), который быстро крис-аллизуется да относительна высокого уровня (порядка.

70% или более) и представляет собой поли-1 -гидроксимасляную кислоту (РНВ)

Цель изобретения - повышение тер- !0 мопластичности полимера за счет понижения его кристапличнасти и хрупкос- ти.

Способ закгпочается в следующем.

В качестве микроорганизмов, праду- 15 цирующих поли-f5 -аксимасляную кислоту, используют культуры способные ассимилировать кислоту или ее соль.

Предпочтитепьными являются штаммы или мутанты бактерий Alcaligenes

eutrophus РР NC!8 11600, NC!В 11599, 11С1В 1!598, ИС13 11597, ATCC 17699

H штаммы бактерий Nocardia salmoni

co or N - ATCC 19149 и АТСС 21243.

1 25

Ферментацию проводят таким образам, чтобы сухой вес полиэфирсадержащих клеток составлял не менее 5 г/л водной срецы. 1тобы получить, например, 10 г/л РНБ-copep> :atqèõ клеток с 30 содержанием РНВ порядка 40 мас.%, количества пита. тельных вещес..в подаваемых в ферментер для аграничени>я рос . та клетат; устанавливают из расчет" поддержания раста б г/л клеток, не содержащих РНВ. Например, если используют азот H качестве ограничивающего рост питательного вещества, та содер>канне азота в свабацных от РНВ бактериальных клетках должно состав- 10 лять 8-15 мас.%,. причем требуемое ко--. личество ассимилируемого азата должна составлять 0,5-0,9 г/л, например 0,61,2 г ионов аммония на 1 литр.

Подходящие кислоты-субстраты долж- 45 ны быть растваримы в воде и поэтому могут добавляться как таковые или в виде водна-раствор мой соли щелочного металла, Предпочтительными являются нропианавая и кзамасляная кислоты. гидракси-замещенные производные этих кислот и маспянай кислоты, например

3-хлор 3-гидроксипрапиановая, а также ненасыщенные кислоты или их гало-замещенные, такие как акрилавая, метакрилавая, 2-хлорпрапионавая кислоты. Используемые кислоты должны давать начало не только повто" ряющимся звеньям (1), когда культивирование проводят в состоянии ограничения роста.

Полимер образуется в виде гранул внутри клеток микроорганизма. Клетки, содержащие полимер, могут быть использованы в качестве формовочного полимера. Желательно отделять полимер от клеток путем их расщепления с последующей экстракцией подходящим растворителем.

Выделенный полимер имеет молекулярную массу от 100 000 и вьппе 200 000.

При нормальном метабализме субстрата, например прапианата, последний превращается в сукцинат, который дает начало ацетил СоА путем окисления элемента трикарбонавой кислоты, TCA цикла Кребса, в щавелевоуксусную кислоту с последующим декарбоксилированием. При декарбоксилировании щавеле.— вауксусной кислоты обе концевые кислотные группы удаляются в виде двуокиси углерода. Следовательно, если пранионат, имеющий атом углерода в карбаксильной группе, который радио14 активно мечен, т e,. 1-С -пропионат, подаетс; к клеткам, то превращение его в ацетил СоА будет осуществляться с оцновременной потерей радиоактивности в виде СО . Любое внедре-.

Я

14 ние. С в полимер должно быть результатам превращения пропианил СоА в р -гидраксивалерил СаА и последующей палвмеризации.

Пример 1. Мутант Alcaligenes

eurrophus NC!В 11599 выращивают в аэробных условиях в 5-литровом периодическом ферментере, содержащем среды следующего "îñòàâà на 1 л деиониэираванной воды:

Глюкоза 3,5 r (ЫН4), SO 2,0 г

NgSOh 7н о 0,8 г

К S04 0,45 r

3 4 !

2 мл

PeSO 7Н,O

fg

15 мг

Следы элементов 24 мл

Раствор микроэлементов:

СиБО4 0,02

ZnSO4 6Н О 0,1

Мп804 4Н О 0,1

СаС1 2Н О 2,6

При достижении концентрации клеток 4,5 г/л, т.е. по истощении ассимилируемога источника азота, в среду вносят 1 г/л прапианата натрия, содержащего 1-С -пронианат, совместно

<4 с г>ооказой и ферментацию продолжают

1375143 в течение 5 мин. Клетки отделяют фильтрацией и полимер экстрагируют хлороформом. Меченый углерод обнаруживают исключительно в хлорофармнам растворе. Это указывает на то, что меченые концевые атомы углерода не теряются в виде двуокиси углерода.

Следовательно, некоторое количество пропионата внедрилось в полимер, отличный от ацетил СоА.

Содержание полимера в клетках 60Х. . Т..пл. 122 С. Зона эндотермы плавления 51 Дж.ч.

П р и и е р 2. Мутант Alcalii.genes

eutrophus NC1B 11599 выращивают в условиях аэрации при рН 6,8 и 34 С в

5-литровом ферментере периодического действия, содержащем 4000 ил водной среды, содержащей на 1л деионизированной воды: (НН ) $04 4 г

М8$О, 7Н О ь

0,8 г

КВ$0 0,45 г

НЗРО4

12 мл 25

FeSO 7Н О 15 мл

Раствор микроэлементов по примеру 1) 24 мл

Глюкозу добавляют са скоростью

8 r/÷, Количество ассимилируемага аза:. .та в среде достаточно для образования 26 г/л несодержащих клеток полиf-гидроксимасляной кислоты {РНВ}, Через 40 ч клетки отделяют центри- „

3 фугированием, сушат вымораживанием и экстрагируют хлороформом.

Содержание полимера в клетках 70Х.

Т.пл. 191 С. Зона эндатермы плавления 127 Дж ч " .

Пример 3. Процесс ведут как в примере 2 за исключением того, что при достижении концентрации клеток

34 г/л в ферментационную среду добавляют пропионовую кислоту вместо глю- 45 козы со скоростью 2 г/ч. Количество полимера в клетках 70Х.

Пример 4. Процесс ведут как в примере 3 за исклочением того, что

50 в момент достижения концентрации клеток 28 г/л в ферментацианную среду вместо глюкозы со скоростью 2 г/ч добавляют изомасляную кислоту в виде раствора, содержащего 150 г/л кислоты, Ферментацию ведут до достижения концентрации клеток 26 г/л PHB с добавлением глюкозы.

Содержание полимера в клетках 50Х.

Пример 5. Процесс ведут как в примере 4 за исключением того, что при достижении концентрации клеток

30 г/л в ферментационную среду падают

4 г 3-хларпропионавай кислоты в концентрации 50 г/л и продолжают ферментащпо в течение 7 ч при постоянном добавлении глюкозы со скоростью

6,8 г/ч.

Количество полимера в клетках 35Х.

П р и и е р 6, Способ осуществляют согласна примеру 2 за исключением того„ чта при достижении концентрации клеток 31 г вместо глюкозы в среду в течение 5 ч добавляют акриловую кислоту са скоростью 4 г/ч с концентрацией 100 г/л.

Содержание полимера в клетках 25Х.

В полученных полимерах определяют количество самономерных звеньев гидролизом и газовой хроматографией методом С-KNP °

13

Молекулярные массы полимеров определяют методом гельпраникаемой хроматографии.

Полученные результаты представлены и табл.1.

Пример 7. В 5-литровый ферментер загружают 3 л среды следующего состава на 1 л,деионизированной воды.

HÄPO, (1,1М) 1,5 мл

М@$0 7Н О 0,8 r

Ре$0 -. 7Н О

15 мг

Раствор микроэлементов {как в примере 1) 36 мл

Ферментер инакулируют выдержанной в течение 48 ч ва встряхиваемой колбе культурой мутанта Alcaligenes

eutrophus NC1B 11599, а затем добавляют 5 r/ä глюкозы. Ферментацию проводят аэробна при 34ОС и регулируемой величине рН 6,8 автоматически с помощью добавления 9:I объем/объем смеси 4М КОН и 4М NaOH. Количество фосфора достаточно для поддержания

8 г/л РНВ клеток свободных от полимера.

Когда вся глюкоза утилизировалась (на этой стадии концентрация клеток около 2,5 г/л), добавляют пропионовую кислоту в виде раствора, содержащего 300 г/л прапионовой кислоты, со скоростью 0;8 г/ч в течение 54 ч., Затем клетки собирают, полимер экстрагируют хлороформом, и анали5 13751 зируют. Получают следующие результаты: конечная концентрация клеток

20 г/л; содержание полимера 60Ж по весу.

Полимер содержит 60 моль Ж бета5 оксибутиратных звеньев и 40 моль 7 бета-оксивалератных звеньев (т.е., где R -- этил) .

Пример 8. Мутант Alcaligenes

eutrophus NClB 11599 выращивают при аэробном культивировании при рН 6,8 и 34 С в 5-литровом ферментере, содержащем 4000 мл водной среды, имеющей следующий состав на один литр деионизированной воды:

Глюкоза 17 r (ИН ) ЯО

4 r

NgS0 7Н О 0,8 г (1,1М) 12 мл

FeS0< 7Н О

15 мг

Раствор микроэлементов (как в примере 1) 36 мл

Величину рН поддерживают на уровне 6,8 с помощью автоматического добавления смесей 9:1 объем/объем 4 M гидроокиси калия и 4 М гидроокиси натрия. Данное добавление смеси КОН/

Na0H для регулирования рН служит так- 30 же для снабжения среды для культивирования калием и натрием.

Количество ассимилируемого азота (обеспечиваемое применением 4 г/л сульфата аммония) было достаточным для поддержания около 6,5 г/л РНВ:

35 клеток свободных от полимера.

Так как для получения 6,5 г/л клеток полимера требуется 16 г/л глюкозы, присутствующее количество глюко- 40 зы было достаточным для обеспечения небольшого избытка углерода. С помощью регулирования концентрации остаточной глюкозы, а также следов давления растворенного кислорода получа- 45 ют ясное указание того, когда системе становится недостаточно ассимилируемого азота. На этой стадии начинают подачу 3-оксипропионовой кислоты в двух экспериментах и 2-окси-масляной кислоты в третьем эксперименте. !

После завершения добавления кислоты клетки собирают с помощью центрифугирования. Образец центрифугирован- 55 ных клеток сушат замораживанием и полимер экстрагируют хлороформом. Полимер анализируют с помощью технологи43 6 ческих приемов газовая хроматография/ масс-спектроскопия (I XNC) .

Результаты представлены в табл.2.

Пример ы 9-13. В каждом примере 250 мл встряхиваемой колбы загружают 50 мл водной среды, содержащей на 1 л деионизированной воды:

Глюкоза 10 г

К HPO 1,9 г

МаН Р )

1,56 r (NH, ) SO„ 1,8 г

Мя$0 7Н О 0,2 г

FeC1 6Н Ъ 0,001 г

9.

Ра с тв ор мих роэлементов (как в примере 1) 1 мл

Величина рН водной среды 7,0. Колбу инокулируют Nocardia salmonicolor и осуществляют выращивание при вращающемся (гироскопическом) встряхивании при 30 С в течение 24 ч. Полученную в результате суспензию saтем центрифугируют. Массу клеток, полученную в результате центрифугирования, затем повторно суспендируют в

50 мл водной среды, идентичной среде, указанной вьппе, за исключением того, что 10 г/л глюкозы заменяют 1 г/л кислоты, а 1,8 г/л сульфата аммония не вносят. Повторно суспендированные клетки встряхивают в течение 24 ч при 30 С, а затем суспензию клеток центрифугируют. Центрифугированную лепешку или таблетку клеток промывают дважды метанолом и анализируют на содержание полимера.

Полимер анализируют с помощью газовой хроматографии/масс-спектроскопии.

Результаты представлены в табл.3.

Более высокие содержания полимера могли быть получены при добавлении дополнительного количества кислоты после культивирования повторно сус- . пендированных клеток в течение 24 ч и продолжении культивирования.

Пример 14. Мутант А.eutrophus С1В 11599 выращивают путем аэроб-L ного культивирования при рН 6,8 и

34оС в 5-литровом порционном фермен1 тере, содержащем от 3500 до 4000 мл водной среды, содержащей на один литр деионизированной воды:

Глюкоза 18 г (МН4) БО4

4 г

MgS0 7Н О 0,8 г

НзРО4 (1,1M) 12 мл

Ре804 7Н О 15 мг

13751

Раствор следовых элементов, тех же, что в примере 1 36 мл рН регулируют на уровне 6,8 путем

5 ав тома тиче ского добавления 9: 1 об . /об. смесей 4 М хлористого калия и 4 M едкого натрия, Это добавление смеси

KOH/Na0H регулирования рН служит для подачи в ростовую среду калия и нат- 10 рия.

Количество ассимилируемого азота обеспечивают 4 г/л сульфата аммония достаточным для поддержания всего примерно 6,5 г/л свободных от полимеров клеток НВ.

Поскольку для получения 6,5 г/л свободных от полимера клеток требуется примерно 16 г/л глюкозы, количества присутствующей глюкозы достаточно 20 для обеспечения небольшого избытка углерода.

Когда концентрация клеток достигает 8,0 г/л в течение 4,5 ч добавляют 1 г/л 2-оксимасляной кислоты, а 25 затем клетки собирают путем центрифугирования, Пробу этих клеток высушивают замораживанием и с помощью хлороформа экстрагируют полимер. Содержание полимера в клетках 242. Тем- 30 пература плавления 174ОС, зона эндо" термы плавления 110 Дж r " .

Пример 15. В этом примере водная среда и условия ферментации, т.е. рН, температура те же самые, что и в примере 14, за тем исключением, что концентрация глюкозы составляет 16 г/л и используют лабораторный ферментер непрерывного действия с рабочим объемом 2 л (приблизительно). Непрерывные условия культивирования устанавливают путем непрерывной подачи в ферментер водной среды и непрерывного удаления соответствующего количества среды из ферментера, обеспечивая среднее время пре.бывания 12,5 ч (т,е. скорость разведения 0,08 ч " ). Затем вводят 3-гидроксипропионавую кислоту в количестве 4,4 г на литр водной среды.

После достижения стабильного состояния содержание остаточной глюкозы составляет О,б г/л, остаточная концентрация ассимилируемого азота меньше 1 мг/л и концентрация клеток составляет примерно 10 г/л.

Полимер собирают из удаленной из фермеитера среды путем центрифугирования, сушки замораживанием и экст43 ракции посредством хлороформа. Содержание полимера в клетках 353.

Т.пл, 171 С. Зона эндотермы плавления 106 Дж г

Пример 16. Повторили пример

15 за тем исключением, что скорости питания регулируют так, чтобы среднее время пребывания составляло

11,8 ч (т.е. скорость разведения

0,095 ч ), и добавляют 3-;гидроксипропионовой кислоты в количестве

2,8 г/л.

После достижения стабильного состояния остаточное содержание глюкозы

0,3 г/л, остаточная концентрация ассимилируемого азота составляет меньше 1 мг/л, а концентрация клеток составляет примерно 9 г/л.

Содержание полимера в клетках 287..

Т.пл, 166 С, зона эндотермы плавления 100 Дж г

Анализ определяет температуру стеклования аморфной фазы, Зоны эндотерм плавления указывают на относительную степень кристалличности.

Полимеры из примеров А, В, и С были подвергнуты анализу ядерной маг13 нитно-резонансной спектроскопией С.

Поведение полимеров при плавлении определяют путем дифференциальной калориметрии со сканированием (DSC) на отожкенных образцах, полученных путем формовки сжатием при 190 С.

Полученные полимеры после отжига обладали значительно меньшей степенью кристалличности, чем контрольный сополимер из примера 2.

Формула изобретения

1. Способ получения полимера, содержащего звенья — О. СН(СН) СН СО-, путем культивирования микроорганизма, способного продуцировать поли- -оксимасляную кислоту, в водной питательной среде, содержащей в течение всего периода культивирования или его части органическую кислоту, или ее производное в качестве ассимилируемого источника углерода и ассимилируемые источники азота и фосфора, о т л и— чающий с я тем, что, с целью повышения термопластичности за счет понижения его кристалличности и хрупкости, культивирование ведут до полного ассимилирования источника азота и/или фосфора, а затем процесс продолжают при использовании от 4 до

1375143

Таблица

1 — тЖ мол. звеньев 11, олекулярная масс полученных Мм . 10

Пример Кислота

Хлор частей методом гидролизо

ЯМР и газовой хроматографией

Мм Мп

Нет

292

2,75

3 Пропионовая

4 Изомасляная

33

4,23

207

29

2,38

0,6

5 3-Хлорпропионовая

311

1,99

45.6,5

6 Акриловая

353

2,36

Таблица 2

Общее количество добавленной кислоты (г/л) Найденный,заместитель

Период, на протяжении которого добавляют кислоту (ч) Кислота

3-Оксипропионовая этил и водород в обоих случаях

3,4

16,5

2-Оксимасля0„5 ная этил

100 мас.Х ассимилируемого источника ,углерода в виде глюкозы или пропионовой, или иэомасляной, или акриловой или З-оксипропионовой, или 3-хлорпропионовой, или 2-оксимасляной кислоты, или их водорастворимых солей щелочных металлов,до накопления продуцен-. том от 20 до 70 мас.Ж получаемого полимера.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем,,что процесс культивирования после ассимиляции азота

1 и/или фосфора ведут при использовании в качестве источника углерода смеси глюкозы и одной иэ вышеуказанных органических кислот или ее соли при содержании в смеси данной кислоты или соли 4-75 мас.X.

3. Способ по п.l о т л и ч а юшийся тем, что процесс культивирования до полной ассимиляции азота и/или фосфора ведут при использовании глюкозы в качестве источника углерода.

12! 375143

Таблица 3

N.Salmonicolor штамм моль. Х

Приблизительное соКислота

3-НВ держание полимера,мас.Х

АТСС 19149

Изомасляная

АТСС 19149

2-Хлорпропионовая 12

Пропионовая

Изомасляная

10

2-Хлорпропионовая 12

П р и м е ч а н и е. 3-Н — бета-оксибутиратные единицы;

3-НУ вЂ” бета-оксивалератные единицы.

Составитель И.Привалова

Редактор А.Лежнина Техред Л.Сердюкова Корректор А.0бручар

Заказ 624/58 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул.Проектная,4

АТСС 21 243

АТСС 21243

АТСС 21243

35 65

63 37

38 72

30 70

38 62