Способ определения липидов в сыворотке или плазме крови

 

Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - повьшение . точности способа. В сьторотке или плазме крови осуществляют избирательный ферментативный гидролиз маскирующих липидных компонентов. Для уделе-, ния маскирующих пики эфиров холесте- . рина триглицеридов их гидролизуют пазами до свободного глицерина и жирных кислот. Затем проводят обработку сыворотки перед хроматографическим анализом и на основании площадей от- . дельных ЛИПИДОВ определяют их соотношения . 3 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (И) ° (51) 4 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3922509/28-14 (22) 04. 07. 85, (46) 29,02.88. Бюл. У 8 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) И.Н. Вавкушевская, В.И. Дворкин, Н;Н. Золотов и В.Н. Малахов (53) 616.015(088.8) (56) 3, Chromatography, 1979, Ч.,162, -Ф 3, р.281-292. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — повышение точности способа. В сыворотке или плазме крови осуществляют избирательный ферментативный гидролиз маскирующих липидных компонентов. Для удале-: ния маскирующих пики эфиров холестерина триглицеридов их гидролиэуют липазами до свободного глицерина и жирных кислот, Затем проводят обработку сыворотки перед хроматографическим анализом и на основании площадей от-. дельных липидов определяют их соотношения. 3 з.п. ф-лы.

1З777ЗЗ

Изобретение относится к биохимии липидов и может быть использовано в медицине, в частности в исследовании липидного обмена и патогенеза атеро5 склероза.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет предварительного ферментативного гидролиза балластных липидов. 10

Способ осуществляют следующим образом.

В сыворотке или плазме крови перед анализом липидов методом хроматографии осуществляют избирательный ферментативный гидролиз маскирующих липидных компонентов. В зависимости от того, какие липиды необходимо уда-. лить, применяют различные ферменты.

Например, для удаления маскирующих 2О пики эфиров холестерина триглицеридов их гидролизуют липазами до свободного глицерина и жирных кислот.

Для удаления эфиров холестерина используют холестеринэстераэу, а для 25 удаления фосфолипидов различные виды фосфолипаэ. Образующиеся при ферментативном гидролизе соединения имеют резко отличающиеся от исходных хроматографические свойства и уже не ме- ЗО шают определению нужных липидов.

Исследуемого сыворотку или плазму крови обрабатывают препаратом липолитического фермента (липаэа, холестеринэстераза или фосфолипаза), после чего проводят обычную обработку сыворотки перед непосредственно хроматографнческим анализом. На основании площадей отдельных .нипидов определяют их соотношения. 4О

Пример 1. 25 мкл сыворотки крови человек;:.. смешивают с 5 мкл препарата микробной липазы (удельная активность 500 ед/мл по гидролизу коммерческой эмульсии кокосового мас- <5 ла "Интралипнд" фирмы "Витрум", ЕЬео ция) и прогревают нри 38 С в течение

20 мин. Затем добавляют 300 мкл изопропилового спирта, энергично встряхивают, центрифугируют при ЗООО об/мин в течение 30 мин, 20 мкл раствора вводят в колонку (4,5х250 мм) для хроматографии в обращенной фазе (Ultrasphеr 098 "Алтекс", СВА) и проводят злюцию системой растворителей нзопропанол — ацетонитрил (65:35 по объему). Детектирование липидов (эфиры холестерина и стероидов) проводят при 205.нм.

На хроматограммах липидемической сыворотки без обработки липазой и после обработки липазой перед экстракцией видно, что индивидуальные хорошо разрешенные пики, соответствующие эфирам холестерина, полностью замаскированы гораздо более, интенсивными пиками триглицеридов.

Трчность определения этих эфиров без обработки липазой с трудом поддается оценке; во всяком случае, общая погрешность превышает 100Х. После обработки липаэой общая погрешность определения данных эфиров холестерина составила 4-6Х.

Концентрация определяемых эфиров холестерина — арахидоната и эфира эйкозапентадиеновой кислоты — составляла в исследуемой сыворотке 0,580,19 ммоль/л соотетственно.

Пример 2. 25 мкл плазмы крови человека смешивают с 10 мкл препа-, рата микробной холестеринэстеразы (удельиая активность 20 ед/мл по гидролизу пальмината холестерина, солю- . билизированному лецитином и.таурохолатом натрия) в буфере, содержащем неконные детергенты {тритон Х-100, Бридж-35 и т.п.), и прогревают при о

37 С в течение 30 мин. Затем добавляют 300 мкл изопрогилового спирта, энергично встряхивают, центрифугируют при 3000 об/мин в течение

30 мин. 20 мкл полученного экстракта вводят в хроматографическую колонку (4,.6 х 250 MM) для хроматографии в обращенной фазе (П1 -as@her ODS

"Алтекс", США) и проводят элюцию в . системе растворителей изопропанол ацетонитрил (70:30 по объему), Детектирование липидов проводят при 205 нм, В данном случае повышается точность определения ацилглицерина, концентрация которых по глицерину

0,18 ммоль/л. Погрешность его огределения уменьшается с 10-12 до 5-6Х.

Изменение времени выхода пикав связано с увеличением полярности подвижной фазы.

Пример 3. 30 мкл сыворо=ки крови человека смешивают с 10 . :. кл препарата микробной фосфолипазы (смесь фосфолипаз А,, С и 01 Удельная активность фосфолипазы составляла

500 ед/мл, фосфолип;.зы С-150 ед/мл„ а фосфолипазы 13 — 35 ец/мл. Определение активности фосфолипаз проводилось по гидролизу лецитина.

13777 3

Формула изобретения

Составитель Н. Гуляева

Редактор Э. Слиган Техред Л.Олийнык Корректор О. Кравцова

Заказ 865/40 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Госуд,",рстненного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

После добавления препарата фермента сыворотку инкубируют при 370п С н течение 30 мин, добавляют 300 мкл . изопропанола, энергично нстряхива5 ют и центрифугируют при 3000 об/мин н течение 30 мин. 20 мкл vîëó÷åííîãî экстракта вводят н колонку для хрсматографии (4,6 х 150 мм) с силихагелем и проводят элюцию системой растворителей гексан — изопропанол — вода (9:8:I по объему). Детектирование липидов проводят при 205 нм. Общая концентрация моноглицеридов в исследуемой в данном примере сыворотке составляла 0,45 ммоль/л по глицерину.

Ошибка определения холестерина и ацилглицерина без обработки фосфолипазами превьппает 100, с обработкой составляет 3-5Х. Погрешность опреде" 20 ления ацилглицерина без обработки ферментами составляет 25-30Х, а с обработкой — 4-5 .

Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно повысить 25 точность определения многих нейтральных липидов методом хроматографии в сыворотке или плазме крови: погрешность определения эфиров холестерина в примере l снижается," более чем

100 до 4-6, погрешность определения ацилглицерина в примере 2 снижается с 10-12 до 5-6Х, погрешность определения холестерина и ацилглицерина в примере 3 снижается с более чем 100 до 3-5Х, ациглицерина в том же примере — с 25-30 до 4-5 . Способ может быть применен для повьппения точности анализа любого биологического материала при использовании подходящих для этой цели ферментов.

1. Способ определения липидов в сыворотке или плазме крови путем экстракции липидов органическим растворителем с последующей жидкостной хроматографией, отличающийся тем, что, с целью поньппения точности способа, при определении липидов исследуемого-класса проводят предварительный гидролиз балластных липидов в пробе.

2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью определения глицеридов, пробу обрабатывают смесью фосфолипаз.

3. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью определения эфиров хслестерина и стероидов, пробу обрабать:нают липазой.

4. Способ по п,l, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью опреде— ления фосфолипидов, пробу обрабатывают холестеринэстеразой.