Способ культивирования бактерий воrdетеllа реrтussis
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для накопления биомассы коклюшных бактерий в 1-й фазе. Цель изобретения - снижение посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, а также стимулирование роста микроорганизмов. Суспензию бактерий Bordetella pertussis в 1-й фазе выращивают в плотной или жидкой питательной среде Штайнера-Шольте, дополнительно содержащей производные о/ -или /з -циклодекстринов в концентрации I - 5000 мгк/мл среды. Посевы инкубируют при 30-38 0 в стационарных или погруженных аэробных условиях.При этом можно получить рост при посевной дозе 10 кл./мл.Для дополнительной стимуляции роста в состав среды вводят казаминокислоты в количестве 0,5-10 мг/мл среды. На плотной среде диаметр колоний составляет 1,0 - - 1,2 мм. 1 з.п. ф-лы, 3 табл. СО
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
vj г
Н flATEHTY
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3505901/28-13 (22) 15.10.82 (31) 56-163477, 56-163478 (32) 15.10.81 (33) JP (46) 23.03.88.Бюл. М II (71) Тейдзин Лимитед (JP) (72) Едзи Суэуки, Ацуси Имайзуми, Хисао Ямагути, Масахару Канесаки и
Содзи Оно (JP) (53) 576.8.093.1 (088.8) (.56) Stainer D.N. Scholte М.J. А
simple Chemicaly Defined Medium for
the Production of Phase I Hordetella
pertussis. — J. of general Microbiology, 1971, v,63, р.211-220. (54) СПОСОБ КУЛЪТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ
B0IIDETELLA PERTUSSIS (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для накопления биомас„,Я0„„1 84206 АЗ
150 4 С 12 N 1/20// (С 12 N I/20, С 12 В 1:01) сы коклюшных бактерий в I-й фазе.
Цель изобретения — снижение посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, а также стимулирование роста. микроорганизмов.
Суспензию бактерий Bordetella per1пззЫ в 1-й фазе выращивают в плотной или жидкой питательной среде
Штайнера-йольте, дополнительно содержащей производные ot -или а -циклодекстринов в концентрации 1
5000 мгк/мл среды. Посевы инкубируют при 30-38 С в стационарных или погруженных аэробных условиях.При этом можно получить рост при посевной дозе 10 кл./мл. Для дополнительт ной стимуляции роста в состав среды вводят казаминокислоты в количестве
0,5-10 мг/мл среды. На плотной среде диаметр колоний составляет 1,0—
1,2 мм. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.
1384206
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для накопления биомассы коклюшных бактерий.
Цель изобретения — снижение посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, а также стимулирование роста микроорганизмов 10
Способ осуществляют следующим образом.
Питательную среду Штайнера-Шольте (ШШ) готовят путем добавления дополнительного раствора, который по- 15 лучают стерилизацией с использованием миллипорового фильтра (0,45 мкм) из водного раствора, содержацего,г:
1-цистеин 4; сульфат двухвалентного железа 1; аскорбиновая кислота 2: 20 никотиновая кислота 0,4; глютатион восстановленного типа на 1 л раствора в концентрации l об. к основной среде 10. Основную среду получают путем приготовления водного раствора, содержацего, г: глютамат натрия 10,7, 1-пролин 0,24; хлористый натрий 2,5; дигидрофосфат калия 0,5; хлористый калий 0,2; хлористый магний 0 l; хлористый кальций 0,02; три- 30 соксиметиламинометан.на 1 л раствора 1,525, значение рН доводят до
7,6, затем стерилиэуют в автоклаве о, при 121 С в течение 15 мин, В зависимости от концентрации микроорганизмов в среду вводят соответствующие количества циклодекстрина (ЦЦ) или. его производной.
) ля усиления роста микроорганизмов наиболее предпочтительным вариан- 40 том среды является питательная среда
ШШ с 0,5-10 г/л казаминокислот.
Для вырацивания культуры можно использовать известные способы и условия. Однако выращивание при встря- 45 хивании является предпочтительным, и его желательно проводить при 30—
38 С в течение 10-100 ч.
ВогйеСе11а pertussis 1-й фазы о штамм Тохама вырацивают при 35 С на среде ШШ, содержащей метил-р-циклодекстрин, в течение 48 ч. Надосадочную жидкость (рН 8,3), полученную центрифугированием культуральной жидкости, подают на колонку с оксиапатитом, уравновешенную 0,01 M фосфатным буфером (рН 8,0), Раствор,выходящий из колонки, подкисляют до рН 6,0 и вновь подают на колонку с оксиапатитом, уравновешенную О 01 М фосфатным буфером (рН 6,0), и затем элюируют связанный белок 0,1 M фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим
0,5 M NaC1, Полученный элюат подвергают аффинной хроматографии, используя гаптоглобин-сефароэу 4В, и затем элюируют целевой продукт 0,1 M фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 0,5 M NaC1 и 3 М тиоцианата калия.
Нитевидный гемагглютинин получают посредством элюирования связанного белка в колонке с оксиапатитом (рН
8,0) 0,1 M фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 0,5 М БаС1, и очицают методом аффинной хроматографии на гаптоглобулин-сефароэе 4В.
Пример 1. 11иофилизированную культуру Bordetella pertussis штамм
Тохама 1-й фазы суспендируют в
1/-ном растворе казаминокислоты и затем выращивают на среде Борде-Генгона (БГ), содержащей 20% лошадиной крови, из которой удален белок, при 35 С в течение 3 сут. Одну полную петлю с культурой растущих клеток стимулируют на среде БГ в течение 24 ч и суспендируют в среде ШШ.
Получают суспенэию концентрацией клеток 5 .10 кл./мл.
Плотную среду ШШ с плотностью агара 1,2, содержацую ЦЦ или его. производную, наносят на пластины, затем распыляют микробную суспензию до содержания 10 клеток на одну 3 пластину.
Результаты роста бактерий (число колоний) после четырехсуточного инкубирования при 35ОС представлены в табл.1.
Пример 2. Суспенэию для ино,кулирования, полученную по примеру
l,инокулируют в 1 млжидкой среды ШШ, содержащей метил-р-ЦЦ при числе клеток 10, и инкубируют при 35 С в Ьпробирке Монода с возвратно-поступательным встряхиванием.
Результаты влияния концентрации метил-р-ЦЦ на мутность среды с культурой в зависимости от времени инку° Ъ баций" приведены в табл. 2.
Из табл. 2 следует,. что при добавлении метил- -ЦЦ в среду в количестве от 1 до 500 мкг/мл степень помутнения среды воэврастает пропорционально количеству ЦЦ, что свидетель1384206
Таблица !
10-100 100-500
CI O (I O i1О CI0 Метил- (-ЦД с!О с!O !0-100 !00-500 500-1000 !00-500 Этил-o(-ЦД <10 il0 10-.100 .10-100 !00-500 !ОО 500 ствует о промотировании роста микробов. Пример 3. Готовят плотную среду ШШ, при этом увеличивают концентрацию глютатиона восстановленного типа в 1,5 раза по сравнению с известной прописью среды, и добавляют различные концентрации казаминокислот и метил-(s-ЦЦ. На каждую пласти- !0 ну со средой высевают 10 клеток 13ordetella pertussis 1-й фазы штамм Тохама и выращивают 3 дня при 35 С. Результаты влияния казаминокислот и метил- -ЦЦ на рост бактерий Bordetella pertussis приведены в табл.3. Из данных табл.3 следует, что в отсутствии добавок на среде ШШ при посевной дозе !О кл./мл рост отсутствует, в то время как при добавлении метил-р-Щ! в интервале 500— 1000 мкг/мл количество колоний возрастает, а при добавлении каэамино- 25 кислоты в количестве от 500 до 5000 мкг/мл размер колоний увеличивается и их легко наблюдать (1,0— 1,2 мм по сравнению с 0,8 мм в контроле). П.р и м е р 4. Жидкую среду ШШ усовершенствованного типа готовят путем добавления каэаминокислоты в / количестве 10 мг/мл. Увеличивают концентрацию глютатиона в 1,5 раза и в 20 раэ концентрацию аскорбиновой кислоты и используют в количестве 1 об.% от основной среды. Метил-р-ЦЦ добавляют в соответствующие пробы среды в количествах от 50 до 5000 мкг/мл. Приготовление пробы сред разливают по 200 мл в колбы Сакагучи. Каждую порцию среды инокулируют суспензией бактерий при концентрации клеток 1,5 ° 10 кл./мл и 45 инкубируют. Полученные результаты свидетельствуют о том, что добавление производного ПД в культуральную среду в количестве от 50 до 2000 мкг/мл в присутствии казаминокислоты усиливает рост клеток Bordetella pert,uss is Использование циклодекстринов позволяет повысить ростовые свойства среды, что в свою очередь позволяет снизить посевную дозу инокулята,стабилизировать процесс культивирования, а добавление каэаминокислот— получать более пышный рост бактерий. Формула изобретения 1. Способ культивирования бактерий Bordetella pertussis в !-й фазе на/или в питательной среде Штайнера-Шольте, содержащей источники углерода, азота, набор минеральных солей, аминокислот и витаминов, в стационарных или погруженных аэробных условиях при 30-38 С, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью снижения посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, культивирование осуществляют в присутствии гексакис-(2,6-о-диметил)-d-циклодекстрина или гептакис(2,6-о-диметил)-р-циклодекстрина в концентрации 1 — 5000 мкг/мл питательной среды. 2. Способ по п.l о т л н ч а ю— шийся тем, что, с целью стимулирования роста микроорганизмов, в питательную среду дополнительно вводят казаминокислоты, при этом в плотный вариант среды добавляют 0 5— 10 мг/кл среды каэаминокислот при концентрации гексакис-(2,6-о-диметил)-Ы-циклодекстрина или гексакис(2,6-о-диметил)-р-циклодекстрина 250-1000 мкг/мл среды, а в жидкий вариант среды казаминокислоты добавляют в концентрации 5-20 мг/мл среды при концентрации циклодекстрина 50— 2000 мкг/мл среды. 1 о Продолжение табл.1 1384206 нцентрации микроорганизмов среды, мкг/мл 1000 2500 5000 CIO BIO BIO (1О 10-100 100-500 Метил-р-ЦЦ Этил-tl-.ПД 410 <10 !00-500 500-1000 500-1000 100-500 <10 10-100 10-100 CIO с10 4 Ф С I О BIO <10 Метил-)-ЦЦ Ы-метилциклодекстрин-at-IQ; гексакис-(2,6-о-диметил)-atциклодекстрин — метил-at-11Ц; гептакис-(2,6-о-диметил)-рциклодекстрин — метил-а-ЦЦ. Т а б л.и ц а 2 П р и м е ч а н и е. епень помутнения среды (ОП 650 ммк) через, ч Концент рация ЦД,мкг/ 0,280 0,490 0,540 0,540 0,340 0,330 0,370 0,500 0,430 0,675 0,430 0,695 100 0,540 0,747 500 0,300 0,485 1000 Таблица 3 Содерж ние ка миноки лоты, мкг/мл О О 116 89 1 64 123 109 О О 98 112 О О О О О О 500! 000 0,005 О,О!О 0,011 0,015 0,015 0,015 0,016 О 007 0,017 0,023 0,024 0,033 0,044 0,037 0,050 0,011 lO-10О l O- I OO lO-10О lOO-500 lOO-500.1384206 Продолжение табл.3 2500 5000 10000 0.0 Составитель Г.Смирнова Техред М.Дидык Корректор О.Кундрик Редактор Н.Тупица Заказ 1357/58 Тираж 520 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1!3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 0 0 0 0 Ф Колонии относительно малого размера. 99 121 102 137 0 74
