Штамм бактерий еsснеriснiа coli vt 2240, используемый для получения диагностической о-сыворотки к эшерихиям серовара 0124

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в производстве сывороточных препаратов. .Цель изобретения - создание нового авирулентного штамма, пригодного для получения специфической сыворот1 и. Штамм п6 - лучен генетическим путем, депонирован в коллекции ткроорганизмов ГИСК им. Л. А. Тарасовича под If 135. При иммунизации кроликов получают иммунную сыворотку с титром 1; 6400. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (46) 30. 10. 90. Бюл. Ф 40 (2!) 3926150/28-13 (22) 05.07.85 (21) 1-й Ленинградский медицинский институт им. акад. И. П. Павлова (72) В. В. Тец (53) 6!5.373.3(088.8) (56) Петровская В. Г. и др. Зависимость динамики раэмнокения знтеробактерий на модели виутрибрюшинного эарюкения юппей в присутствии катионов железа от наличия и типа К-антигенов. ЖИЭИ, 1! 9, 1983, с. 53-59. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI ЧТ 2240 ° ИСПОЛЬЗУЕИЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕ„80„„1 378370 А i (5l)5 С 12 Я 1/20, А 61 К 39/395// (С 12 Я 1/20, С !2 К 1:19) НИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ О-СЫВОРОТКИ К

ЭШЕРИХИЯИ CEPOBAPA 0124 (57) Изобретение относится к мефи цинской микробиологии и мокет быть использовано в производстве сыворо точных препаратов..Цель изобретения - создание нового авирулентного штамма, пригодного для получения специфической сыворотки. Штамм получен генетическим путем, депонирован в коллекции микроорганизмов

ГИСК им. Л. А. Тарасевича под 1! !35.

При иммунизации кроликов получают. . иммуннув сыворотку с титром I:6400.

4 табл.

1 3>7 8 3 70

Изобрнт . I>Hp относится к медининсKoA мнкробнологин н мажет быть Нс пОЛ>.зонано и производстве сывороточ" ных препаратов.

Целью изобретения является соэS дание нового авирулентного штамма, пригодного для получения специфической сыворотки.

Штамм бактерий F.. со11 VT 2240 получен следующим образом.

2,5 мл 0,77. аминопептидного агара при температуре 45 С смешивают с

2,0.10 клеток зшерихий IC 10240 »

9 >

1,0 10 фаговых частиц (фаг PI vir), вь>ливают на чашку с засть>вшим

2,07.-ным аминопептидним агаром. и смесь выращивают при температуре

37 С в reчение 20 ч, после чего смывают 0,77.-ный агар, добавив 2,0 мл амннопептндного бульона, К полученной смеси добавляют 0,5 мл хпороформа, встряхивают 40 с и затем разделяют центрифугирбванием при

3000 об/мин 30 мин. Отбирают надосадочную жидкость, представляющую с0бой лизат фага PIvir. Для осуществления трансдукции бактериальную культурурецнпиент VT1240 выращивают на амнно" пептидном бульоне в течение 15-1б ч, разводят 0,857.-ным раствором хлорида натрия в 3 раза и осаждают центрифугированнем при 2500 об/мин в течение 30 мин при 20 С, Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в прежнем объеме раствором хлорида натрия и вновь осаждают при том же режиме центрифугирования.

Процедуру отмывки повторяют 4 раза.

Из обработанных таким образом бакте" рий готовят взвесь, содержащую 1,0

>1О живых клеток в 1,0 мл. K 1,0 мл такой взвеси добавляют трансдуцирующий бактериофаг в концентрации 2,0 "

10- клеток (О,1 мл), после чего инкубнруют смесь при 37 С в водяной бане в течение 45 мин, а затем при

22 С в течение 30 мин. Центрифугиру-, ют смесь при 2500 об/мин 30 мин при о

?О С для осаждения бактерий. Надосадочную жидкость, содержащую неадсорбированные фаговые частицы, сливают. Гесуспендируют осадок в 0,3 мл раствора хлорида натрия и засевают

55 по 0,15 мл на чашки с аминопептидным агаром, содержащим 10,0 мкг/мп тетрацнклиня ° Трансдуктанты выращивают í >(ние 48 ч. Отбирают колонин, соответе твую>кие 8-Формам. Отобранные клоны проверяют на чувствительность к ультрафно.петовому облучению, для этого засевают параллельными штрихами, идущими через всю поверхность чашки Петри с 27.-ным аминопептидным агаром. Половину чашки облучают УФ в дозе 20 Дж/м и после этого инкубируют в темноте при

37,0 С в течение 18 ч. Трансдуктанты, приобретшие ген rec А 56, не дают роста на облученной стороне чашки, В то же время клетки, несущие исходный гес А ген, малочувствительны в данной дозе КФ и дают нормальный рост на облученной и необлученной сторонах чашки Петри ° Отобранный таким образом штамм повышенной чувствительности к УФ обозначен

UT 2240, Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ГИСК им. Л. А. Тарасевича под Ф 135 и характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки .

Грамотрицательная неподвижная палочка, находящаяся в форме, даюmaÿ положительную реакцию с метилротом и отрицательную с фогес-Прос" кауэра.

Растет на основных питательных средах (амино- и мясопептонной среде, Эндо, Левина, синтетической среде M9), имеет характерную для данного серовара биохимическую активность, чувствительность к антибиотикам и антигенную структуру (табл. 2, 3) .

В области srl гена (ферментация сорбита) встроен транспозон Тп 10, это определяет отсутствие ферментации сорбита и устойчивость к тетрациклину. За счет замены rec А гена на мутантный rec А 5á штамм VT 2240 имеет в 1000-10000 раэ повышенную чувствительность к УФ и практически лишен способности к законной рекомбинации ДНК.

Пример. Для получения О-агглютиннрующих сывороток против эшерихий серовара 0124 проводят иммунизацию кроликов, Штамм выращивают на аминопептндном или мясопептонном скошенном агаре в течение 22 ч при о

37 С. Микробную массу смывают физраствором и готовят взвесь. содержащую 10 м,кл./мл. Кр>пику подкожно

1:.478370!

О.Т а б л и н а

Характер роста бактерий ятвммв Vt2240 на равлмчных аитательнык средвк ьнвл среда

44лоскнре

4 у - 95 490»-4 ° 5

4,6-1,5

4,0-4,5

1,0-4 5

4aÎ-1 5

4,0»1,5

Рваар, ввв

4(руглые сяабовы»

nyxaaus

Круглые слабовы»

Яуклые

4(руглые Круглее слабо вы- слабовыJlуклие яуклвве

Kpynwe слабо вы» я уклые

4(руглые слвбовыл уклые круглые слабовыяукльз»

Вяавнав блестав(вв

Влвхнал Влавлал блествлва бластлв4ак

Влекла а блестав4ва

Вламиаа блестялаа

Влавнал блествлаа

Влввнаа блествяав

Сероватые Сероватые

Корична" . Сероватые ввтые

Сероватые Сероватые

Ровный хрвй

Ровный

«рвй

Ровный край

Ровный край

Ровный краМ

toewaiA край

Ровный хра44

Соответ- Соответствует ствует форне форме .

Гемолив отсутствует соот» ветствует форме

Соответствует форме .

Соответ" ствует форне

Соответ ствует форме

Соответ ствует форме

Структура

Тволицв 2

Фермеятвтявявя вктявяость

V%2240 KI К(67 KI - К (К) K

4 к +. суткя) K - ферментвцял до кяслоты, Kl - фермеятвцяя ло кяслотм я rasa. вводят 1 мл микробной взвеси. Через

4-5 дней 1 0 мл аналогично приготовленной микробной взвеси вводят кролику внутривенно. Через 4 дня вво" дят 2,0.мл такой же микробной взвеси, и еще через 4 дня - 4 мл микробной взвеси. На 8-й день после последнего введения кролика обескровливают и отделяют сыворотку. Полученная сыворотка содержит антитела в титре 1 6400 (развернутая реакция агглютинации, табл. 4), Использование авирулентного штам" ма F., со11. Ф 435 позволит получать специфическую сыворотку высокого титра.

Формула и э о б р е т е н и я

Штамм бактерий Eacherichiа coli VT 2240, 44 135 (коллекция ГНИИСК медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича), используемый для получения диагностической

0-сыворотки к эшерихиям серовара

0124.

i пяло

f ° 6вюаа 3

Otaoeeaes а емтябавтаз зм (метод Фееиоа) Зу е- Левоюю- Nbre

НВВМН йФФЗПФ lOtlWll

vT 2240 8 ° и Б k 5 В В C В 9 а R R!

1 31 !Ф 37 . 20 И» . !7" 36 4» П»

k - чувствютввай, В уемйеэмй, + - лиаметр еоам угзатамив роста

Таблица а

Развернутая реакция агглвтивацни

VT2240 (Ф !эъ)к а ; а и

Фв ° В

Ж эявая культура, K кипяченая культура.

Появлеыиа агглютниацни в динамике раэведения смвороъкш «арактерно для

«ивмх н кипяченное культур эаерикий саровара 0124 °

Составитель Г. Смирнова

Техред Л.Сердвкова Корректор М. Иакснмишинец

Редактор Л. Павлова

Заказ 4354 Г . Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР . по делам.изобретений и открытий

Il3035,. Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Ф а йВ ° Ю ° В ЮФ ЮВ 4Э

Произв .лс твенно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4