Способ разделения лейкоцитов

 

Изобретение относится к медицине , аименно к иммунологии. Цель изобретения - упрощение способа и одновременное получение лимфацитов, макрофагов и нейтрофилов. Для этого промытые физраствором, забуференным фосфатами, клетки перитонеального экссудата лабораторных животных осаждают центрифугированием 8 мин при 1200 g и 2-4°С. Клетки, содержащие лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы, ресуспендируют в среде Игла, содержащей 20% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и 10 мМ HEPES (рН 7,2), и наносят на культуральные пластиковые чашки, поверхность которых предварительно обработана в течение 2 ч последовательно 2%-ным водным р-рон декальцинирован .ного желатина и декальцинированной эмбриональной телячьей сывороткой. Клетки инкубируют 1,5 ч при 37 С в атмосфере 5%-ного COj. Неприлипшие лимфоциты получают 3-кратным промыванием монослоя р-ром Хенкса и собирают центрифугированием. Отделение макрофагов производят встряхиванием культуральных частей в течение .30 мин, затем их собирают, центрифугированием . Получаемые нейтрофилы остаются на покрытой желатином пластиковой поверхности. i СЛ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9) (11) заюлзлез

2. и ; «,ГЗ Еет бт и йи ) (5D4G 01 N 33 52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АBTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ гг-. б

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3941401/28-14 (22) 07.08.85 (46) 15.04.88. Бюл. и - 14 (71) Институт иммунологии (72) С.А,Николаев, А.В.Храмцов, В ° М.Земсков и И.С,Калько (53) 615.373(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 1123645, кл. G 01 N 33/53, 1982. (54) С11ОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине, а. именно к иммунологии. Цель изобретения — упрощение способа и одновременное получение лимфацитов, макрофагов и нейтрофилов. Для этого промытые физраствором, забуференным фосфатами, клетки перитонеального экссудата лабораторных животных осаждают центрифугированием 8 мин при

1200 g и 2-4 С. Клетки, содержащие лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы, ресуспендируют в среде Игла, содержащей 20Х инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и 10 мМ

HEPES (рН 7,2), и наносят на культуральные пластиковые чашки, поверхность которых предварительно обработана в течение 2 ч последовательно

2Х-ным водным р-ром декальцинирован.ного желатина и декальцинированной эмбриональной телячьей сывороткой. о

Клетки инкубируют 1,5 ч при 37 С в атмосфере 57.-ного СО . Неприлипшие лимфоциты получают 3-кратным промыванием монослоя р-ром Хенкса и собирают центрифугированием. Отделение макрофагов производят встряхиваиием

Ю культуральных частей в течение

30 мин, затем ик собирают. центрифугиронанием. Получаемые нейтроюилы остаются на покрытой желатином пластике- С вой поверхности.

1388809

Формула изобретения

Составитель Е.Ярных

Редактор Т.Парфенова Техред А.Кравчук Корректор В.Бутяга

Тираж 847

Заказ 1576/47

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,.Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэводс .пенно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. П; эектнач, 4

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Целью изобретения является упрощение способа и одновременное получе5 ние лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов.

Пример. Экспериментальной моделью являются клетки перитонеальноно эксудата мышей СВА интактных и с 10 различными сроками внутрибрюшинной инъекции пептона. Клетки перитонеального эксудата получают промыванием брюшной полости мышей физиологическим раствором, забуференным фосфа-15 тами (NaC1 128 мМ, ИаН РО„ 10 мМ, рН 7,2), затем осаждают центрифугированием в течение 8 мин при 1200 8 при 2-4 С. Клетки (40х10 ), содержа,щие 3,84х10 лимфоцитов, 25,68х10 2р макрофагов и 10,48х10 нейтрофилов

6 ресуспендируют в среде Игла, содержащей 20% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и 10 мМ НЕРЕЯ (рН 7,2) и наносят на культуральные б пластиковые чашки (2х10 /мл), поверхность которых предварительно обрабатывают в течение 2 ч последовательно

2%-ным водным раствором декальцинированного желатина и декальцинирован- 3р ной эмбриональной телячьей сывороткой. Чашки перед нанесением клеток ополаскивают физиологическим раствором, эабуференным фосфатами (pH 7,2). о

Клетки инкубируют при 37 С в течение

90 мин в атмосфере 5% СО . Неприлипшие лимфоциты получают трехкратным промыванием монослоя раствором Хенкса и собирают центрифугированием, при этом выход 81%, чистота 92%. После этого к монослоям клеток добавляют 3 мл раствора, представляющего собой смесь 1:1 (среда Игла, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 10 мМ этилендиамино-тетрауксусная кислота в физиологическом растворе, забуференном фосфатами, рН 7,2). Отделение макрофагов от поверхности проводят при встряхивании культуральных чашей в течение 30 мин, после чего -их собирают центрифугированием, при этом выход 54%, чистота 94%. Получаемые нейтрофилы остаются на покрытой желатином пластиковой поверхности, выход их 50%, чистота 96%. Идентификацию выделяемых предлагаемым способом клеток проводят с помощью окраски по Романовскому-Гимэа и на неспецифическую эстеразу, являющуюся маркерным ферментом для макрофагов и моноцитов.

Использование изобретения позволяет получить лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы с высокой степенью чистоты и выхода в течение 2-3 ч.

Способ разделения лейкоцитов путем центрифугирования и отбора целевых продуктов с последующей их очисткой, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и одновременного получения лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов, после центрифугирования клетки наносят на пластиковую поверхность последовательно обработанную 2%-ным водным раствором декальцинированного желатина и декальцинированной эмбриональной телячьей сывороткой.