Способ криоконсервирования ткани

 

Изобретение относится к биологии и медицине, предназначено для. низкотемпературного консервирования тканей с их последующей трансплантацией . Цель изобретения - повышение эффективности способа за счет сохранения функциональных свойств ткани. Для этого определяют оптимальное время инкубации ткани, для чего определяют температуру начала кристаллизации воды в ткани или максимальное увеличение объема ткани в процессе кристаллизации, строят графики зависимости первого или второго показателя от времени инкубации и по времени движения уровня насыщения определяют время инкубации ткани. Затем ткань инкубируют с криопротектором

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУЬЛИН (51)4 А 01 N 1 00.с

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3985501/28-14 (22) 10. 12. 85 (46) 07.05.88. Бюл. Р 17 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (72) A.È. Осецкий, В.А. Чуйко, В.А. Моисеев и В.И. Аненко (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 572252, кл. А 01 N 1/00, 1977 ° (54) СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ТКАНИ (57) Изобретение относится к биологии и медицине, предназначено для. ниэкотемпературного консервирования тканей с их последующей трансплантацией. Цель изобретения — повышение эффективности способа за счет сохра„„SU„„1393382 А 1 нения функциональных свойств ткани.

Для этого определяют оптимальное время инкубацни ткани, для чего определяют температуру начала кристаллизации воды в ткани нли максимальное увеличение объема ткани в процессе кристаллизации, строят графики зависимости первого нли второго показателя от времени ннкубации и по времени движения уровня насыщения опре.1 деляют время инкубаций ткани. Затем ткань инкубируют с криопротектором (107.-ный водный р-р диметилсульфоксида) в течение 5-5 10 с при +10 С.

После инкубации ткань охлаждают до

-80 С со скоростью 1,5 /мин. 3 ил.

3 табл.

1393382

Изобретение отнссится к биологии и медицине и может быть использовано при низкотемпературном консервировании тканей с целью последующей их трансплантации.

Целью изобретения является повышение эффективности способа за счет сохранения функциональных свойств ткани. 10

Пример 1. Щитовидную железу быка разрезают на кусочки размером

2х4х12 мм (именно такой размер используется для последующей трансплантации реципиенту) и составляет из них образцы для исследований объемом

0,5 см каждый.

Образцы помещают н пробирки, содержащие по 5 см 10%-ного водного раствора диметилсульфоксида(ДМСО)р инкубируют различное время от 5 до

5 10 с при температуре +10 Ñ, После инкубации образцы последо" вательно помещают в рабочую ячейку устройства для теплофизических ис- 25 следований и охлаждают от +10 до

-80 С со скоростью 1,5 /мин. В процессе охлаждения одновременно на независимых двухкоординатных графопостроителях записывают дилатограммы и термограммы охлаждаемых образцов, по которым определяют температуру Т „„ начала кристаллизации воды в тканях образцов и максимальное увеличение макс объема 3 V „этих гканей при кристаллизации.

На фиг; 1 и 2 приведены графики зависимостей величин Т„ и - Л7„ /7 от времени инкубации tдд„, полученных путем измерения теплофизических пара- 40 метров образцов, инкубированных от

5 до 5-10 с.

Из приведенных кривых видно, что, как температура начала кристаллизации Т, так и максимальное увеличение объема при кристаллизации 8V „ макс 45 кР непрерывно уменьшаются по мере увеличения времени инкубации вплоть до значения t ù 40 мин, Полученные зависимости Т „,;-Й(Ь„„„ ) мс « и ДЧ „ =f(t ц„,) отражают кинетику проникновения молекул криопротектора в ткань и позволяют определить оптимальное время инкубации. Это время определяется непосредственно по параметрам, отражающим защитное действие криопротектора.

Выход величин Л „" и BT „р на насыщение после некоторого времени инкубации означает окончание тех процессов изменения молекулярной структуры ткани под действием криопротектора, которые непосредственно влияют на характер кристаллизации воды в ней.

Зто позволяет повысить точность определения. величин t „ .Если например, за to„, выбрать время, в течение которого взаимодействующий с тканью криопротектор успевает реализовать

90% своих защитных свойств, то, исходя иэ графикон (фиг.1 и 2) можно определить, что t,„ =40 t 1,5 мин.

Известный способ, определяющий концентрацию криопротектора лишь в растворе, не позволяет делать выводы о кинетике его взаимодействия с тканью, что принодит к погрешностям при определении tо т н десятки минут.

Результаты исследования способности щитовидной железы к аккумуляции радиоактивного йода после замораживания — оттаивания в зависимости от времени инкубации ее в 10%-ном растворе ДМСО приведены в табл. 1.

Представленные в табл. 1 данные показывают, что насыщение щитовидной железы 10%-ным ДМСО обеспечивает криоэащитный эффект после 40 мин инкубации, который сохраняется и после б0 мин инкубации. Дальнейшая инкубация (120 мин) не приводит к повышению жизнеспособности, это говорит о том, что к 40-60-й мин произошло полное насыщение ткани.

Пример 2. Из фрагментов селезенки быка размером 2х4х12 мм подготавливают 12 образцов объемом

0,5 смз каждый. Зти образцы помещают в пробирки, содержащие по 5 см

30%-ного водного раствора этиленгликоля, и инкубируют при +10 С в течение различных отрезков времени от

5 до 5 -10 с. После инкубации их поочередно помещают в рабочую ячейку устройства для теплофизических исследований растворов и тканей и охлаждают от +10 до -80 С со скоростью 1,5 /мин. В процессе охлаждения образцов регистрируют их объем как функцию температуры.

На основании полученных кривых строят график зависимости

1393382 где ЬУ м„„о — максимальное изменение

1 объема образца при его кристаллизации;

V — значение объема образца при +10 С (т.е. Va

= О 5 см ).

4У мс кс .Типичный вид зависимости (— — — -=

Vo

f (t „„„) для обра зцов, и нкубир уемых в ЗО .-ном водном растворе зтиленгликоля, показан на фиг. 3. Иэ графика следует, что оптимальное время инкубации образцов селезенки в данном случае составляет 9 10 140 с (15,0+ з 2,3 мин).

Результаты исследования активности включения "4С-аминокислот в суммарные белки селезенки после замораживания — оттаивания в зависимости от времени инкубации ее в ЗОХ-ном растворе этиленгликоля (ЭГ) приведены в табл. 2.

Представленные данные показывают, 25 что криозащитное действие ЗОХ-ного раствора этиленгликоля проявляется только после 90 и 120 мин инкубации в них ткани селезенки. В этих условиях .сохраняется 68-70 . -исследуемой активности, в то время как после

5-60 мин инкубации активность включения С-аминокислот не превышает

43Х. Дальнейшая инкубация (180 мин) также не приводит к повышению жиз- 35 неспособности, что указывает на то, что уже к 90-120 мин инкубации происходит насыщение ткани селезенки этиленгликолем, необходимое для проявления ее криозащитного эффекта. 40

Способ также применим для определения времени инкубации тканей с непроникающими криопротекторами. Основное действие последних состоит в дегидратации инкубируемых в них тканей. 45

Потеря тканью слабо связанной воды также приводит к заметному уменьшению объемного эффекта при ее кристаллизации, что позволяет и в этом слуопт макс чае определять t „щ по кривым dVÄ = 50

- („„„) .

Пример 3. Щитовидную железу быка разрезают на фрагменты размером

2х4х12 мм и составляют из них образцы для исследований объемом Vо = 55

* 1 см каждый, Эти образцы инкубируют раздельно в пробирках, содержащих по 10 смз

ЗО -ного водного раствора ПЭО-ЗООО, который является непроникающим криопротектором. После инкубации вновь замеряют объем образцов V и снимают с них дилатограммы в процессе охлаждения от +10 до -80 С по указанной методике. Из полученных дилатограмм макс определяют МУ как функцию времеkp ни и нкуб а ции.

Данные проведенных экспериментов приведены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что по мере увеличения времени инкубации фрагментов железы в ЗОХ-ном водном растворе ПЭО-3000 их .объем непрерывно уменьшается. Это демонстрирует эффективность дегидратации тканей в процессе инкубации. Вместе с тем по мере увеличения t уменьшается. и объемный эффект при кристаллизации тка : от 11,5% при tинк =О до 3,9Х при t„„k 600 мин, выходя после

600 мин инкубации практически на насьпцение. Исходя иэ полученных данолт ных определяют t„к . Принимая за опт время, при котором реализуется опт

90 . защитного эффекта, имеют пн

100 мин + 2,0 мин.

Этот результат достаточно хорошо подтверждается данными по исследованию способности щитовидной железы к аккумуляции радиоактивного йода.

Формула изобретения

Способ криоконсервирования ткани, включающий инкубацию ткани с криопротектором с предварительным определением оптимального времени инкубации и последующим охлаждением, о т л ич а þ ù è é с я тем, что, с целью повьппения эффективности способа за счет сохранения функциональных свойств ткани, определяют температуру начала кристаллизации воды в ткани или максимальное увеличение объема ткани в процессе кристаллизации, строят графики зависимости первого или второго показателя от времени инкубации и по времени достижения уровня насыщения определяют оптимальное время инкубации.

1393382

Таблица 1

Включение к контролю,7

Условия эксперимента

Интактная щитовидная железа (контроль}

0,169 0,011

Инкубация с 0,9% NaCl

Инкубация с ДМСО,мин:5

0,078+0,006

О, 058+0,009

40

120 О, 168+0, 015

Таблица 2

Условия эксперимента Включение C-аминокислот к контролю,7.

Интактная селезенка (контроль) 0,294+0,04

О, 108+0 06

Инкубацня с 0,9% NaC1

О, 094+0, 01

Инкубация с ЭГ, мин: 3

О, 128+0, 03

60

0,211+0,04

120

180

0,196<0 07

Таблица 3

Включение J к контролю,7

100

11,5

10,9

86

6,4

70

4,7

100 .

600

3,9

0,099+0,008

О, 141 0, 014

Оэ 171+Оэ015

О, 144+0,02

0,119 0 02

О, 189+0, 03

-р- -100% dV „ /V,7. о

О, 74+0, 02

0,31 0, 01

О, 068+ О, 01

О, 049+0, 02

О, 051+0, 01! 393382

1393382

Редактор А. Шандор

Заказ 1899/3 Тираж 455 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэводственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 е н

< so

4с

10 а 10 апг инк

Дрема иинуЯЖ „„„, с

ЧЬЕ,5

Составитель А, Агуреев

Техред М,Моргентал Корректор С. Черни