Штамм актиномицета sтrертомyсеs virginiae nrrl 15156 и 12525 - продуцент антибиотического комплекса а 41030 и способ получения антибиотического комплекса а 41030

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства антибиотиков. Цель изобретения - изыскание новых штаммов - продуцентов антибиотика, эффективного против стафилококков и стрептококков, и разработка способа его получения. Антибиотический комплекс А 41030, содержащий факторы А, В, С, D, Е, F, G получают с помощью штаммов Streptomy-- ces virginiae, которые депонированы в коллекции NRRL под номерами 15156 и 12525. Продуцент выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли.. Культивирование ведут в глубинных аэробных условиях при перемешивании

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К AATEHTY

ГОСУДАРСТВЕНКЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3562652/28-13 (22) 17.03.83 (31) 361301; 443496; 361102 . (32) 24.03.82; 22.11.82 (ЗЗ) US (46) 07.05.88. Бюл. М 17 (71) Эли Лнлли энд Компани (US) (72 ) Ральф Эмиль Кастнер (US)

Карл Хейнц Мичел (DE) и Вальтер Мицуо Накацукаса (US) (53) 615.779.93(088.8) (56) Патент США II 4322343, кл. 260-112.5, 1981.

Патент GIIA М 4322406, кл. 424-118, 1981. (54 ) ШТАММ - АКТИНОМИЦЕТА. STBEPTOMYCES

VIHGINIAE NRRL 15156 И 12525 — ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА

А 41030 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА А 41030 (57) Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства антибиотиков. Цель изобретения — изыскание новых штаммов — продуцентов

„SU „„1395146 А 3

Ш 4 С 12 P 1/06 //(С 12 P 1/06, С 12 R 1:465) антибиотика, эффективного против стафилококков и стрептококков, и разработка способа его получения. Анти- . биотический комплекс А 41030, содержащий факторы А, В, С, D, Е, F, G получают с помощью штаммов Stre@tom@.=

ces vwginise, которые депонированы в коллекции NRRL под номерами 15156 и 12525. Продуцент выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли..

Культивирование ведут в глубинных аэробных условиях при перемешивании (0,1-0,5 U воздуха/V культ,ж./мин, 100-300 об/мин соответственно) в течение 48"210 ч при 10-34 С. Затем отделяют жидкую фракцию, очищают и выделяют антибиотический комплекс. При необходимости комплекс хроматографически разделяют на отдельные факторы, которые проявляют более высокую антибактериальную активность. Эти соединения можно переводить в соответствующие соли. Даны структурные формулы факторов А, В, С, D, Е, F. 2 с. и

6 э.п. ф-лы.

1395146

NRRL.12525 хороший

Рост: обильный

Субстратный мицелмЪ: 72.а.ОУ»

90.gY.Y+

Воздушный обильный мицелий: 63.1.brgY отсутствует

Растворимый пигмент: отсутствует отсутствует плохой

ISP 9 3

Рост: хороший серый

93.Y обильный

Субстратный серый мицелий: 93.7 обильный

Воздушный мицелий: хороший отсутствует

63.1 Ъг Х

Растворимый пигмент: отсутствует отсутствует плохой

ISP У 4

Рост: обильный

Субстратный мицелий:

89.р Л

89.рЛ

Воздушный обкльньй мицелий: 63. 1 Ьг8У отсутствует

Растворимый пигмент: отсутствует отсутствует плохой

Рост: обильный

ISP

Субстратньй мицелий: 89.рЛ

89.рЛ

Воздушный обильный мицелий: 22.rgY отсутствует

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения антибиотиков.

Целью изобретения является изыска5 ние штаммов — продуцентов нового антибиотического комплекса А 41030 и разработка способа его получения.

Штамм Streptomyces virginiae ysr-. делен иэ образца почвы, собранной в штате Индиана. Штамм депонирован в

Agricultural Research Culture Collection под номером NBBL 15156. Из этого штамма путем обработки митомициСреда ISP В 2 NBRL 15156 ном С и N-метил-N -ннтро-N-нитрозогуанидином получен мутант Streptomyces virginiae>xovopsd3 депонирован в той же коллекции под номером NBRL

12525.

Культурально-морфологические признаки. Штамм NRRL 15156 продуцирует хорошо развитый воздушный мицелий и спорофоры спиралевидной формы, однако встречаются крючки и петли. Штамм

NRBL 12525 воздушного мнцелия и спор .не образует.

1395146

Растворимый пигмент: отсутствует отсутствует

Агар Чапека

Рост: умеренный

Субстратный серый ./ мицелий: 26 4.1 отсутствует

Воздушный плохой мицелий: 10.рКдУ

Растворимый пигмент: отсутствует

Рост; обильный хороший

Субстратный мицелий:

72.d.OY

54.ЬгО

Воздушный обильный мицелий: 63.1.brgy отсутствует

Растворимый пигмент: отс утс тв уе т отсутствует

Названия цветов указаны в соответствии с цветовой картой стандартных образцов Р 2106 ISCC — NBS Centroid (1958) и Color Harmony Manual (4-е изд., 1958).

Физиолого-биохимические признаки.

Оптимальная температура роста 10—

34 С (NRRL 12525) и 10-37 С (ИВВ?

15156). Штамм NRRL 15156 хорошо усваивает целлобиозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-мальтозу, D-рибозу, салицин, сукцинат натрия, плохо усваивает

В=фруктозу, не усваивает ацетат натрия, D-арабинозу, L-арабинозу, изоинозит, лактоэу, Э-маннит, мелибиозу, раффинозу, рамнозу, сахарозу, D-ксилозу. Штамм NRRL 12525 хорошо усваивает целлобиозу, Э-галактозу, )3-глюкозу, D-мальтоэу плохо усваивает сали- . цин, сукцинат натрия, не усваивает аце» тат натрия, D-арабинозу, L-арабинозу, D-фруктозу, изоиноэит, лактозу, D-мании т, мелибио э у, раффинозу, рамноэу, D-рибозу, сахароэу, D-ксилозу.

Нитраты в нитриты не восстанавливают. Меланоидные пигменты продуцируют на среде ISP 11 1 и ISP 11 6, не продуцируют на среде ISP У 7. Снятое молоко частично гидролизуют. Крахмал ие гидролизуют. Желатину не разжижают. Переносимость NaC1 : NRRL 15156

4X» NRRL 12525 ЗЖ.

Предпочтительные источники азота— соевая крупа, соевая мука, арахисоBG мука, pb16HBH мука, мясной пелтон, .свиная кровяная мука.

Предпочтительные источники углерода — декстрин, крахмал, манноэа, глицерин, хлопковое масло.

4п Антагонистические свойства, Проявляет активность в отношении грамположительных микроорганизмов, в том числе стафилококков и стрептококков.

Пример 1, Готовят питательную среду следующего состава, г/л: декстрин 10,0;

»

-дрожжевой экстракт 1,0; ферментативный гидролизат казеина 2,0; мясной экстракт 1,0; СоС1 - 6 Н О 0,01; деБ< пониэированная вода до 1 л. рН среды доводят до 7,3 с помощью 5 н.NaOH стерилизуют, рН после стерилизации

6,9. Среду скашивают. Для засева среды используют споры штаммов 15156 ипи 12525 и инкубируют посевы в течение 6 дн. при 30 С. Споры смывают стерильной дистиллированной водой.

1 мл суспензии инокулируют 50 мл посевной среды следующего состава, 1/л: глюкоза 20,0; соевая крупа или мука

l5 0; жидкая кукурузная вытяжка 10,0;

СаСО 2,0; вода водопроводная до l л (для штамма NRRL 12525); глюкоза

15,0; декстрин 20,0; соевая мука или крупа ) 5,0; жидкая кукурузная вытяжка

10, О; СаСО 2, О; водопроводная вода до 1 л (для штамма NRRL 15156). рН среды доводят до 6,5 с помощью

5 н.NaOH, после автоклавирования рИ среды 7,0.

Посевной материал выращивают в

250-миллилитровой широкогорлой колбе

Эрленмейера, содержащей 50 мл среды, при 30 С в течение 48 ч на встряхива,теле, вращающемся по дуге с б 5 см со скоростью 250 об/мин.

Полученный инокулюм можно повторно выращивать по описанному методу для увеличения количества посевного материала . либо в количестве около

l на объем среды использовать для засева ферментационной среды.

В 50 мл ферментационной среды вносят I (0,5 мл) посевного материала, при этом используют среду следующего состава, г/л: декстрин 30 0; соевая

0,005; NUTSO "7 Н О 1,0; МаЛО 1,0;

СаСО 2,0 (для штамма NRRL 12525

4 0); депонизированная вода до 1 л.

К HPÎ добавляют в среду после ее автоклавирования.

Культуру выращивают в 250-миллилитровой колбе Эрленмейера при температуре примерно 30 С в течение 45 дн. на встряхивателе, вращающемся по дуге r) = 5 см при 250 об/мин..

Для воспроизведения способа в промышленном масштабе в 165-литровый ферментатор заливают 100 л среды ука- . занного состава, в которую вносят посевной материал штамма NRRL !2525.

Ферментацию ведут в течение 210 ч при температуре около 32 С. Аэрацию осуществляют со скоростью

0,25 V воздуха/7 культ.ж./мин, перемешивание — со скоростью 200 об,мешалки/мин.

Пример 2. Полученную по примеру 1 культуральную жидкость, фильтруют на фильтр-прессе с использованием диатомовой земли..Фильтрат наносят на колонку, содержащую 100 л смолы Diaion HP-20, со скоростью протока 4 л/мин. Колонку промывают последовательно 300 л воды и 1000 л смеси метанол:вода (l:3) со скоростью

1395)46 б

4 л/мин. Элюирование проводят смесью метанол:вода (l;1) со скоростью

6 л/мин и собирают фракции по 100 л, 5 которые подвергают контролю на биоло-. гическую активность.

Фракции 2-15 объединяют, концентрируют при пониженном давлении и концентрат лиофилизируют. Получают

1О 220 r сырца антибиотического комплекса.

110 г сырца растворяют в 5 л смеси метанол:вода (1:)), доводят рН до

)0 0 с помощью МаОН и фильтруют.

Фильтрат наносят на колонку со скоростью 50 мл/мин (30-литровая колонка, заполненная Сефадексом С-: О, крупнодисперсная, уравновешен я смесью метанол:вода 1;1). Сод:-.ржимое колон20 ки элюируют смесью м; -анол:вода (l:)) со скоростью 50 мл/мин, собирают фракции объемом 3 л. Фракции 1324 концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают

25 35,7 r антибиотиче"кого комплекса.

Комплекс А 41030 растворим в воде, разбавленной водной кислоте, разбавленном водном основании, смеси метанол:вода, этанол:вода, диметилформамиде и смеси диметилформамид:вода, диметилсульфоксиде, смеси диметилсульфоксид:вода, ацетонитриле, ацетоне, этилацетате, тетрагидрофуране или метиленхлориде.

Антибиотический комплекс состоит из факторов А, В„ С, D, Е, G.

Пример 3. Выделение фактора А.

8 г комплекса.А 41030 растворяют в 200 мл растворителя (смесь вода: ацетонитрил:БаС1 84:16:2 г/л) и фильт руют. Фильтрат наносят на колонку из нержавеющей стали (8х100 см), заполненную 4 л силикагеля в обратной фазе

LP I/Ñ с размером. частиц 10-20 мкм.

Содержимое колонки элюируют со скоростью 60 мл/мин смесью вода:ацетонитрил:ИаСЬ,(84:16:2 г/л), получают фракции объемом 480 мл. Элюаты конт50 ролируют при 254 нм с использованием

УФ-монитора ISC0 модель- ИА-5 с оптической установкой типа 6. Отбирают фракции 52-79, обогащенные фактором

А, объединяют их и концентрируют при пониженном давлении до объема 500мл.

Концентрат доводят до рН 8,2 .с помощью ИаОН и фильтруют. Фильтрат наносят со скоростью 15 мл/мин на 100 мл смолы Diaion HP-..20, помещенной в ко1395146

20 лонку 2, 8х22 см, предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают

400 мл воды с рН 2,5 до исчезновения в промывной воде хлоридов. Элюирование проводят смесью вода:ацетонитрил, (8:2) со скоростью 15 мл/мин и собирают фракции по 1 л. Фракции анализируют на активность против Вас. subtilis. !О

Кристаллический фактор А, который образуется во фракции 2, после охлаждения выделяют фильтрованием (389,6 мг). Фракция 1 и фильтрат фракции 2 порознь концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют.

Получают 731,8 и 514 мг фактора А соответственно, Фактор А представляет собой белое кристаллическое твердое вещество.

Элементный анализ, : С 56,44;

Н 3,58; N 8,11; 0 23,2; Cl 8,29.

Молекулярная масса 1231. Эмпирическая формула С58 Н С1зМ Ощ.

Электролитическое титрование фак- 25 тора А в 66 -ном диметилформамиде в воде показывает присутствие трех титруемых групп, имеющих рКа около 5,53;

7,60 и 10,37 с возможными дополнительными величинами рКа больше 10,5 (пер- 30 воначальное значение рН 7,83). Удельвращение: ы — 19 6 (С 9>0 в диметилсульфоксиде).

Спектр инфракрасного поглощения в таблетках KBr. Наблюдаются следующие различимые максимумы абсорбции„ см

3448-3226 (сильчая широкая), 1653 (сильная), 1610 (слабая), 1587 (средняя), 1515 (сильная), 1488 (слабая), 1429 (средняя), . 1227 (сильная), 40

1139, (средняя), 1064 (сильная) и 1010 (сильная).

УФ-спектрофотометрия в смеси метанол:вода (1:3) в кислотных и щелочных условиях 278 (11,100) нм (Ю), в основной среде 298 (17,200} нм {Е).

Фактор А растворим в смесях спирта и воды, диметилсульфоксиде и диметилформамиде и их смесях с водой, разбавленных водных растворах кислот и оснований.

Пример 4. Выделение фактора В.

1 r антибиотического комплекса растворяют в 35 мп растворителя (ацетонитрил:NaC1:вода 15:2:85 г/л) и раствор наносят на стеклянную колонку

Мишель-Миллера размером 4,7х45 см для жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности, при низком давлении (НРLPLC) заполненную смолой с размером частиц 25-40 мкм ЛиХропрен

НР-18 углеводородная фаза (С ), химически связанной с силикагелем. Элюируют со скоростью 21 мл/мин тем же растворителем. Собирают фракции объемом 21 мл. Элюат контролируют при

280 нм с помощью УФ-детектора. Фракции 184-245 объединяют и концентрируют при пониженном давлении до объема 25 мл. Концентраты 7 аналогичных очисток объединяют, разбавляют до

1,4 л водой и наносят со скоростью

8-10 мл/мин на 100 мл смолы Diaion

HP-20, помещенной в колонку, предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают 600 мл воды до исчезновения в промывной воде хлоридов. Элюирование проводят смесью вода:метанол (1:1) со скоростью 8-10 мл/мин и собирают фракции объемом 300 мл. Фракции анализируют на активность против

Вас. subtilis. Фракции 1-5 объединяют, концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают

523 мг неочищенного фактора В.

550 мг двух объединенных неочи-. щенных факторов B растворяют в 10 мл растворителя (вода:ацетонитрил:дибутиламин 75:25:0,03M, рН 7,8), при этом гидроксид тетрабутиламмония добавляют до полного растворения. Растворз наносят на колонку размером

2,8х59 см Мишель-Мюллера HPLPLC из стекла, заполненную смолой с размером частиц 25-40 мкм ЛиХропрен БР-8 углеводородная фаза (С ), химически связанной с силикагелем. Элюируют со скоростью 5 мл/мин тем же растворитслем. Фракции объемом 27 мл анализируют на присутствие фактора В с помощью аналитической HPLC системы на колонке из нержавеющей стали размером 4,6х250 мм, заполненной смолой с размером частиц 100 мкм ЛиХро- сорб НР-18. Растворитель, состоящий из воды, ацетонитрила и дибутиламина (82:18:О, 03М, рН 2,5), пропускают со скоростью 1 мл/мин.

Фактор В обнаруживают при 225 нм.

Порцию элюата, обогащенную фактором

В, объемом 999-1296 мл концентрируют до объема 200 мл, концентрат разбавляют до объема 500 мп, доводят рН до

2,0 фосфорной кислотой и добавляют

1.мг/мл NaC1. Раствор наносят со скоростью 20 MJI/ìèí на 100 мп смолы

Пример ра С.

9,0 г комплекса А 41030 растворяют в 200 мл растворителя, состоящего из смеси вода:ацетонитрил:NaCl (83117:

:2 г/л), и раствор фильтруют. Фильтрат наносят на колонку из нержавеющей 55 стали размером 8х100 см, заполненную

4 л силикагеля в обратной фазе c раз- мером частиц 10-20 мкм марки.LP-I/Cr, 5. Выделение фактоа

1а951

Diaion HP-20 в колонке размером 2,8х х 22 см, предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают 500 мл воды, доведенной до.рН 2,5 водной муравьиной кислотой, до полного отсутствия в промывной- йоде хлоридов.

Содержимое колонки злюируют 1 л смеси вода:ацетонитрил (6:4) со скоростью 30 мл/мин. Элюат концентрируют f0 при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 295,6 мг сырца фактора В.

285 мг препарата растворяют в 30мл смеси диметилформамид. вода (4:6) при 15 нагревании, затем охлаждают до комнатной температуры и выдерживают в холодильнике. Фактор В выпадает в оса" док, который отделяют фильтрованием, промывают ацетоном и сушат в вакууме. 20

Получают 84 мг фактора В.

Фактор  — белое твердое вещество.

Элементный анализ, 7.: С 58,54; Н 4,21;t

N 8,63; Cl 5,96; О 22,66.

Электрометрическое титрование в 25

667.-HoM диметилформамиде в воде показывает присутствие двух титруемых групп при величинах рКа около 5,6 и

7 5 соответственно, с возможными дополнительными величинами рКа более 10 30 (начальная величина рН 6,22). Молекулярная масса 1197. Эмпирическая фор-, мула С ЬНа С1-т1ЧтОе

Спектр инфракрасного поглощения в таблетке KBr. Наблюдаются следующие

-Т различимые максимумы поглощения, см

3448-3226 (сильная широкая), 1653 (сильная), 1610 (средняя), 1587 (слабая), 1515 (сильная), 1488 (слабая), 1429 (средняя), 1290 (слабая), 40

1227 (сильная), 1139 (средняя), 1064 (сильная) и 1010 (сильная).

Максимумы УФ-поглощения в нейтраль ной, кислой и основной среде в смеси метанол:вода 1:1 (278) 9,600 нм (Е) 45 и 298 (16.,800) нм (Я) соответственно.

Фактор В растворяется в тех же растворителях, что и фактор A.

46 10

Элюируют со скоростью 60 мл/мин тем же растворителем и собирают фракции объемом 480 мл. Элюат проверяют при 254 нм с использованием УФ-детектора ISCQ модели HA-5. Фракции 2852, обогащенные фактором С, объединяют и концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл.

Концентраты двух аналогичных очисток объединяют, фильтруют и наносят со скоростью 10 мл/мин на 100 мл смолы Diaion HP-20 в колонке 2,8 х х 22 см, предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают водой (2 л) до исчезновения в промывной воде хлоридов. Элюируют 1 л смеси вода:ацетонитрил (6:4) - скоростью

15 мл/мин. Элюат концентрируют при пониженном давлении " .чиофилизируют.

Получают 2,75 г смеси факторов, обогащенной фактором С. 1,25 мг этой смеси растворяют в 25 мл растворителя (вода:ацетонитрил:дибутиламин 80, 20:

:0,3 М, рН 7,8) при добавлении гид-. роксида тетрабутиламмония до завер шения растворения. Пробу смеси наносят на колонку из стекла Мишель-Миллера размером 2,8х59 см, заполненную смолой с размером частиц 25-40 мкм

ЛиХропрен RP-8, элюируют со скоростью

4 мл/мин тем же растворителем. Фракции объемом по 28 мл анализируют на наличие фактора С с помощью аналитической хроматографии HPLC на колонке из нержавеющей стали размером 4,6 х х 150 мм, заполненной Нуклеосилом С, с размером частиц 10 мкм. Растворитель-вода:ацетонитрил:ацетат натрия (81:19:2 г/л, рН 6 с помощью ледяной уксусной кислоты). Пробу пропускают со скоростью 1 мл/мин.

Элюат проверяют при 254 нм с использованием ISC0 модель ИА.-5 УФдетектора, Фракции объемом 28 мл анализируют на наличие фактора С с помощью аналитической хроматографии HPLC как описано.

Часть злюата в количестве 4,2—

5,1 л, обогащенного фактором С, концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл.

Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют и растворяют упри добавле- нии фосфорной кислоты до рН 1,7. В: качестве ионного маркера добавляют

NaCl 1 мл/мл. Образец наносят со скоростью 20 мл/мин на 100 мл смолы

Diaion HP-20 в колонке размером 2,8х х 22 см, предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают водной муравьиной кислотой с рН 2,5 (300 мл) до отсутствия хлоридов в промывной воде. Содержимое колонки элюируют

1 л растворителя (вода:ацетонитрил

16:4) со скоростью 30 мл/мин. Элюат собирают, концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 0,87 r частично очищенного фактора С. Полученный продукт растворяют в 20 мп растворителя (вода:ацетонитрил:дибутиламин 80:20:0,03 М, рН 7 с использованием Н РО ) при добавлении гидроксида тетрабутиламмония до полного растворения. Образец хроматографируют на стеклянной колонке

Мишель-Миллера размером 2,8х59 см, наполненной ЛиХропрен PP-8 с размером частиц 25-40 мкм. Часть элюата в количестве 2,45-3,2 л концентрируют при пониженном давлении до объема

500 мл.

Концентраты от 2 сходных очисток объединяют и обессоливают на колонке содержащей смолу Diaion. HP-20, как описано. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют.

Получают 688 мг фактора С. 678 мг . фактора С растворяют в 60 мл смеси вода:ацетонитрил (6:4) при нагревании, затем раствор охлаждают и осаждают фактор С. Осадок отделяют фильтрованием, промывают ацетоном и сушат под вакуумом. Получают 428 мг факто3 ра С.

Фактор С антибиотика А 41030 - 6eлое твердое вещество. Элементный со- 4 став, 7: С 48,87; Н 4,39; N 6,16;

С1 6,96; О 33,81. Электрометрическое титрование фактора С в 667-ном диметилформамиде в воде показывает присутствие 2 титруемых групп при вели4 чинах рКа около 5,5 и 7,1 соответственно с возможными значениями рКа больше 10.

Молекулярная масса около 1393.

Эмпирическая формула С Н 4С1. N Î °

Спектр инфракрасного поглощения в таблетке KBr. Наблюдаются следующие максимумы поглощения, см : 34483226 (сильная, широкая), 1653 (сильная), 1610 (средняя), 1587 (слабая), 1504 (сильная), 1481 (слабая), 1429 (средняя), 1220 (сильная), 1136 (сильная), 1064 (слабая), 1053 (средняя), 1005 (сильная).

1395146 12

Максимумы УФ-поглощения в кислой или щелочной и нейтральной средах в смеси метанол: вода (1:1) 278 (8,400) и 298 (14,000) нм (Е) соответственно.

Фактор С растворим в тех же растворителях, что и фактор А.

Пример 6. Выделение фактора D.

10 6,0 г комплекса растворяют в 200 мл растворителя, состоящего из смеси вода:ацетонитрил:NaC1 (83:17:2 г/л), и раствор фильтруют, фильтрат наносят на колонку из нержавеющей стали размером 8х100 см, заполненную 4 л силикагеля в обратной фазе 1Р-?/С, с размером частиц 10-20 мкм. Содержимое колонки элюируют со скоростью

60 MJI/ìèí тем же растворителем, со20 бирают фракции объемом 480 мл. Элюат проверяют аналогично методикам, описанным в примерах 3-5. Фракции 35—

53 объединяют, концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл.

25 Концентраты от 2 сходных очисток объединяют, разбавляют водой до объема 3 л, наносят со скоростью 8—

10 мл/мин на 100 мл смолы Diaion

HP-20 в колонке (2,8х22 см) ° предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают 300 мл воды до исчезновения хлоридов. Элюируют 1 л растворителя (вода:ацетонитрил б:4) со скоростью 8-10 мл/мин. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 2,33 г смеси факторов, обогащенной фактором D

1,15 г смеси факторов растворяют в 25 мл растворителя (вода:ацетонитрил:дибутиламин 80:20:0,03 М, рН 7,8 с помощью Н РО ) с добавлением гидроксида тетрабутиламмония до полного растворения. Образец наносят на стеклянную колонку Мишель-Миллера разме-. ром 2,8х59 см, заполненную смолой с размером частиц 25-40 мкм ЛиХропрен

RP-8, и элюируют со скоростью 5 мл/мин тем же растворителем. Элюат проверяют, отбирают порции объемом 2,6-3 4 л и концентрируют при пониженном давлении до объема 300 мл.

Концентраты от 3 аналогичных очисток объединяют и растворяют,при добавлении фосфорной кислоты до рН 7,7.

В качестве ионного маркера добавляют

NaC1 (1 мг/мл). Образец наносят со скоростью 20 мл/мин на 100 мл смолы

Diaion HP-20 в колонке (2,8х22 с ), предварительно уравновешенной водой.

1395146

Колонку промывают 300 мл воды, рН 2,5 (водная муравьиная кислота) до исчезновения хлоридов в промывньх водах.

Элюируют 1 л смеси вода:ацетонитрил (6:4) со скоростью 30 мл/мин. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 0,63 г частично очищенного фактора D. Этот продукт растворяют в 15 мл раствори- 10 теля (вода:ацетонитрил:дибутиламин

80:20;0,03 М, рН 7,8, фосфорная кислота) с добавлением тетрабутиламмония до полного растворения. Раствор хроматографируют на ЛиХропрене HP-8 с размером частиц 25-40 мкм в стеклянной колонке Мишель-Миллер размером

2,8х59 см, как описано. 2,5-3,0 л концентрируют при пониженном давлении до объема около 200 мл. Концент- 20 рат обессоливают на колонке, содержащей смолу Diaion HP-20, как описано в примерах 3-4. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 193 мг частично очи- 25 щенного фактора D.

259 мг 2 объединенных частично очищенных фракций фактора D растворяют в 6 мл растворителя, состоящего из смеси вода:ацетонитрил:двухосновной..фосфат натрия (82:18:О,ОЗМ, рН

7,8, фосфорная кислота), и доводят до рН 10 водным раствором 5 н.гидроксида натрия. Раствор наносят на стеклянную колонку Мишель-Миллера размером 2,8х59 см, наполненную Ли35

Хропреном HP-8 с размером частиц 2540 мкм, элюируют со скоростью 4мл/мин тем же растворителем. Элюат проверяют как описано. 40

Порции элюата объемом 405-1134 мл концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл и обессоливают на колонке (как описано). Элюат концентрируют при пониженном давлении и лис- 45 филизируют. Получают 120 мг фактора D, Фактор D антибиотика А 41030— белое аморфное твердое вещество. Элементный анализ, 7.: С 54,46; Н 4,351

Б 7,58; С1 4,27; 0 29,34.

Электрометрическое титрование фактора Э в 667.-ном диметилформамиде в воде показывает присутствие двух титруемых групп при рКа около 5 5 и 7,6 соответственно.с возможными дополнительными величинами рК более 10 (начальная рН 6,83). Молекулярная масса около 1326.

Спектр инфракрасного поглощения фактора D в таблетке KBr. Наблюдаются следующие различимые максимумы абсорбции, см : 3448-3226 (сильная, широкая), 2959 (слабая), 1661 (сильная), 1592 (сильная), 1511 (сильная), 1429 {слабая), 1290 (слабая), 1227 (слабая), 1212 (средняя), 1163 (слабая), 1443 (слабая), 1053 (средняя) и 1010 (сильная).

Максимумы УФ-поглощения в кислой или щелочной среде 278 (10,600) нм

{ Я), в основной среде 298 (19,900) нм (е) .

Фактор D растворим в,,ех же растворителях, что и фактор А.

Пример 7. Р".щеление фактора Е антибиотика A 41030.

0,3 г комплекса А 41030 растворяют в ЗО мл растворителя (вода:ацетонитрил. NaCl 85:15:2 г/л) и наносят на стеклянную колонку Мишель-Миллер размером 2,8х59 см, заполненную ЛиХропреном HP-8 с размером частиц 25—

40 мкм, Элюирование осуществляют со скоростью 12 мл/мин тем же растворителем, собирают фракции по 24 мл и отбирают после контроля фракции 55122, обогащенные фактором Е. Фракции объединяют и концентрируют при пониженном давлении до объема 50 мл.

Концентраты 13 .аналогичных очисток объединяют, разбавляют до 1,5 л водой и наносят со скоростью 5 мл/мин на

100 мл смолы Diaion HP-20 в колонке (2,8х22 см), предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают

900 мл воды до исчезновения в:,промывных водах хлоридов. Элюируют смесью вода:метанол (1:1} со скоростью

l0 мл/мин и собирают 300-миллилитровые фракции. Фракции 1-8 объединяют, концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 1,04 г смеси факторов, обогащенной фактором

Е. 0,5 л лиофилизата растворяют в

10 мл растворителя (вода:ацетонитрил.

:ИаС1 84:14:2 г/л) и наносят на колонку Мишель-Миллера (как описано). Элюируют со скоростью 5 мл/мин тем же растворителем и собирают фракции по

25 мл. После анализа фракций элюат объемом 1520-1780 мл койцентрируют при пониженном давлении до объема

50 мп.

Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют, разбавляют водой до 1 л и наносят на колонку со скоростью

1б

1395146

iO мл/мин на 100 мл смолы Diaion

HP-20 в колонке (2,8х22 см), уравновешенной водой. Колонку промывают

200 мл воды, доведенной до рН 2,5 водной муравьиной кислотой. Элюируют

0,5 л смеси вода:ацетонитрил (6:4) со скоростью 15 мл/мин. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 202,2 мг 10 частично очищенного фактора Е, концентрат растворяют в 4 мл растворителя (вода;ацетонитрил: NaC1 86:14:

:2 г/л) и хроматографируют со скоростью 4 мл/мин на колонке Мишель-

Миллер. 2060-2480 мл злюата, o6oraщенного фактором Е, концентрируют при пониженном давлении до объема

50 мл. Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют и обессоливают на 20 колонке Diaion HP-20. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 24 мг фактора Е.

Фактор Е антибиотика А 41030белое твердое вещество. Элементный. анализ, Ж: С 56,06; Н 4,06; N 8,53;

С1 3,50; О 27,85.

Электрометрическое титрование фактора E в бб -ном диметилформамиде в воде показало присутствие двух титруемых групп при величинах рКа около

5,8 и 7,7 соответственно с возможными дополнительными значениями рКа более 10„ начальная величина рН 6,57.

Молекулярная масса около 1163. Эмпирическая формула С з8Н С1И тО а .

Спектр инфракрасного поглощения фактора Е в таблетках KBr. Наблюдаютследующие Различимые максиму я 40 поглощения, см: 3448-3226 (сильная, широкая), 1653 (сильная), 1600 (средняя), 1504 (сильная), 1429 (слабая), 1290 (слабая}, 1198 (средняя), 1136 (слабая), 1064 (слабая}.. и 1010 45 (сильная) .

Максимум УФ-поглощения в щелочной или кислой среде 278 (8,500) нм (8) и в основной среде 298 (15,500) нм (Е). Растворим-в тех же растворителях что и фактор А.

Пример 8 Вцделение фактора

F антибиотика- А 41030.

9 r комплекса растворяют в 200 мл растворителя (вода:ацетонитрил. NaC1

83:17:2 г/л) и раствор. фильтруют.

Фильтрат наносят на колонку из нержавеющей стали размером 8х100 см, заполненную 4 л силикагеля в обратной фазе с размером частиц 10-20 мкм

Lp-, Х/С, Элюируют со скоростью

60 мл/мин тем же растворителем. Собирают фракции по 480 мл. Элюат проверяют при 254 нм с использованием

УФ-детектора. Отобранные фракции анализируют на наличие фактора F с помощью аналитической .системы HPLPLC на колонке из стекла Мишель-Миллера "размером 0,8х30 см, заполненной ЛиХропреном RP-8 с размером частиц 25—

40 мкм. Растворитель (вода:ацетонитрил НаС1 84:15:2 г/л) пропускают со скоростью 4 мл/мин. Фракции 26-36 объ+ единяют и концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл.

Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют, фильтруют и фильтрат наносят со скоростью 10 mr/мин на

100 мл смолы HP-20 в .колонке размером

2,8х22 см, уравновешенной водой. Колонку промывают 900 мл воды. Элюируют

1 л смеси вода:ацетонитрил (б:4) со скоростью 15 мл/мин. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 2,6 г частично очищенного фактора F.

500 мг концентрата растворяют в

10 мп растворителя (вода:ацетонитрил:

:NaC1 84:16:2 г/л), доведенного до рН 7,0 гидроксидом натрия. Раствор наносят на стеклянную колонку МишельМиллера размером 4,7х45 см., заполненную ЛиХропреном RP-18 с размером частиц 25-40 мкм. Элюируют со скоростью б mr/мин тем же растворителем. Собирают фракции по 24 мл. Порцию элюата после контроля объемом 1940-2520 мп концентрируют при.пониженном давлении до объема 300,мл.

Концентраты 2 аналогичных очисток объединяют и наносят со скоростью

20 мл/мин на 100 мл смолы Diaion

HP-20 (2,8х22 см), уравновешенной водой, Колонку промывают 300 мл воды, доведенной до рН 2,5 муравьиной кислотой. Элюируют 0,75 л смеси вода:ацетонитрил (6:4). Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 299 мг фактора F.

Фактор F антибиотика А 41030— белое твердое вещество. Элементный анализ, : С.51,39; Н 3,96; Cl 6,45;

N 6,45; 0 28,65.

Электрометрическое титрованне в

663-ном диметилформамиде в воде по- казывает присутствие двух титруемых групп при величинах рКа, соответст17

1395146

l8 венка около 5,4 и 7,1 с возможными дополнительными величинами рКа больше 10 (начальная величина рН 5,93)., Молекулярная масса около 1555. ЭмпиРическая формула С ) H+4C1>NzО

Инфракрасный спектр поглощения в таблетке KBr. Наблюдаются следующие ! различимые максимумы поглощения, см

3448-3226 (сильная, широкая), 1653 lp (сильная), 1600 (средняя), 1504 (сильная), 1429 (слабая)„ 1258 (слабая},1227 (сильная), 1136 (сильная), 1075 (сильная), 1053 (сильная) и !

010 (сильная).

УФ-максимумы поглощения в кислой или щелочной среде, 278 .(9,300) нм (Е), в нейтральной среде 298 (14,500) нм (1.:).

Растворим в тех же растворителях, 2р что и фактор А.

11 р и м е р 9. Выделение фактора С антибиотика А 41030 ..

8 г комплекса А 41030 растворяют в 200 мл растворителя вода:ацетонит- 25 рил:ИаС1 84:16:2 г/л) и фильтруют.

Фильтрат наносят на колонку из нержавеющей стали (8х100 см), заполненную 4 л силикагеля в обратной фазе

LP-I/C,® с размером частиц 10-20 мкм. 30

Элюирование ведут со скоростью

60 мл/мин тем же растворителем и со-.. бирают фракции объемом 480 мл, фракции 22-35„ обогащенные фактором G объединяют и концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл.

Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют, доводят рН до 8,5 гидроксидом натрия и фильтруют. Фильтрат наносят со скоростью 10 мп/мин на 40

100 мл смолы Diaion HP-20 в колонке (2,8х22 см), уравновешенной водой.

Колонку промывают 400 мл воды, доведенной до рН 2,5 муравьиной кисло- той. Элюируют смесью вода:ацетонитрил (6:4} со скоростью 15 мл/мин и собирают фракции по 1 л. Активные фракции объединяют, концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 2,85 г частично очищенного фактора G.

0,5 г концентрата растворяют в

10 мл растворителя (вода:ацетонитрил:

:дибутиламин 80:20:0,03М, рН 7,8, фосфорная кислота) с добавлением дибутиламина до полного растворения 55 концентрата (конечная величина рН 8,2). Раствор наносят на колонку

Мишель-Миллера HPLPLC размером 2,8х х59 см, заполненную ЛиХропреном RP-8 с размером частиц 25-40 мкм. Колонку элюируют со скоростью 4 мл/мин тем же растворителем.

Фракции 54-74, обогащенные факто— ром G, объединяют с фракциями 2 аналогичных очисток и наносят со скоростью 10 мл/мин на 100 мл смолы Diaion

HP-20 в колонке (2,8х22 см)„уравновешенной водой. Колонку промывают 300 мл воды, доведенной до рН 2,5 муравьиной кислотой. Элюируют 0,75 л смеси вода:

:ацетонитрил (6:4). Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 960 мг фактора G.

Фактор G антибиотик.. А 1030 — белое твердое вещество., Элементный анализ„ %: С 50,02; Н 4, .1; Cl 4,74;

N 6,11 0 30,70.

Электрометрическое титрование в

66%-ном диметилформамиде в воде показывает присутствие двух титруемых групп при величинах рКа соответственно около 5,4 и 7,0 с возможными дополнительными значениями рКа больше 10,5 (начальная величина рН 6,32).

Молекулярная масса около 1684.

Спектр ИК-поглощения в таблетках

КВг. Наблюдаются следующие различимые максимумы поглощения, см": 3320 (очень широкая, сильная), 2975 (резкая, слабая), 2920 (резкая, слабая), 1659 (нормальная, сильная), 1594. (широкая, сильная), 1512 (резкая, сильная), 1492 (плечо), -1430 (резкая, слабая), 1386 (широкая, слабая), 1337 (широкая, слабая }, 1308 (резкая, слабая), 1264 (резкая, слабая), 1 230 (широкая, средняя }, 1145 (широкая, средняя), 1077 (резкая, средняя), 1062 (резкая, средняя), 1014 (резкая, средняя) и 846 (широкая, средняя) .

Максимумы УФ-поглощения в кислой или щелочной среде 278 (15, OOO) нм (e} в нейтральной среде 298 (18,000) нм (Ы .

Фактор G антибиотика А 41030 растворим в тех же растворителях, что и фактор А.

Поскольку несколько факторов являются амфотерными, содержащими аминогруппу, и/или выполняют функцию карбоновой кислоты, они способны образо-. вывать соли с кислотами и/или основаниями такими, как серная, фосфорная, соляная, уксусная, янтарная, лимонная, молочная, малеиновая, фумариновая, пальмитиновая, холевая, памовая, 1395

OH

О О

x l

НΠ— СН g g СН

l l

1 t

ГМ 0% ГСН. 0=С-Ш о С

Д

С MH C н C=O СН СН

НО-С Н2

С1 цо

О

НО

19 муциновая, D-глутаминовая, D-камфорная, глутаровая, гликолевая, фталевая, винно-каменная, муравьиная, стеариновая, салициловая метансульфоУ

5 кислота, бензолсульфокислота, сорбинов ая, пикриновая, б ензойная, к оричная, гидроксид натрия, карбонат натрия, карбонат калия, гидроксид кальция, гидроксид калия, триметиламин, 10 гидроксид алюминия, диэтаноламин и дре

Антибиотический комплекс А 41030 и его факторы активны против грамположительных микроорганизмов, включая стафилококки и стрептококки (в дозе менее 0,5 мкг/мп).

Эти антибиотики также способствуют ускорению роста и улучшению эффективности кормления домашней птицы, 20 свиней и крупного рогатого скота.

Фактор A проявляет также антимикробную активность в отно1пении E. coli

Hemophilus influential, Neisseria вр. Shigella flexneri, анаэробных 25 ,бактерий рода Bactегоides u Propioni

bacterium аспез.

Факторы А, В и С проявляют антимикробную активность в отношении анаэробных бактерий рода Peptococc u

Peptostreptoccus.

Все выделенные факторы активны пропротив ряда штаммов Clostridium difficile в дозах от Й),25 до 2,0 мкг/мп и ряда других микроорганизмов, натагенных для живого организма.

Таким образом, антибиотический комплекс А 41030, содержащий семь индивидуальных факторов, обладает анти4. Способ по п. 2, о т л и ч а— ю шийся тем, что иэ антибиоти146 20 микробной активностью в отношении широкого круга микроорганизмов.и, в частности, в отношении Staphylococcus и Streptococcus, устойчивых к пенициллину. Кроме того, полученные антибиотики могут применяться в составе кормов для ускорения роста цыплят и свиней, а также для повышения удоев у молочного крупного рогатого скота.

Формула изобретения

1. Штамм актиномицета Streptomyces virginiae NRRL 15156 и 12525 (Agricultural Research Culture) Collection) — продуцент антибиотического комплекса А 41030, 2. Способ получения антибиотического комплекса А 41030, заключающийся в том, что штамм Streptomyces vir giniae NRRL 15156 или штамм Streptomyces virginiae NRRL 12525 культивируют в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральной соли, в глубинных условиях при температуре 10-34 С в течение 48

210 ч при скорости аэрации от 0,1 до 0,5 об.воздуха/об. культ. жидкости/

/мин и перемешивании 100-300 об./мин с псследующим отделением мицелия, выделением целевого продукта из жидкой фракции, и при необходимости полученный комплекс разделяют на факторы А, В, С, D, E, F и/или G.

3. Способ по и. 2, о т л и ч аю шийся тем, что из антибиотического комплекса выделяют фактор А

А 41030 структурной формулы ческого комплекса выделяют фактор

В А 41030 структурной формулы .

1 95146

2!

ОН

0 0

HO eH 1 С1 с1 СН2

1 1 си, р ск 0 i cH

Н0 — С Н2

О

НО

НО OH

О ,, . г1

НΠ— СН д1 СН

1 1 ..

Л

О=С мн 0%e О,,СН,, СН

О ЮН С NH =О

il 1 Снг С AH С=0

С СБ СН

СБ

С1 Н2

НО— но

Галактиа-О

6. Способ по п. 2, о т л и ч аю шийся тем, что из антибиотического комплекса вьделяют фактор D

А 41030 структурной формулы

0Н

О О

НО- СБ С1 иг

1 уО l i О l о яв С н, юн

ll 1 " б б

НО-С СК Сн СН

39Н2

О

Н0

НО

7. Способ по п. 2, о т л и ч" а — ческого комплекса выделяют фактор Е ю шийся тем, что из антибиоти- А 41030 структурной формулы

5. Способ по п. 2, о т л и ч а — ческого комплекса вьделяют фактор С ю шийся тем, что из антибиоти-, 2-0 A 41030 структурной Ф. рмулы

1395146

23

0Н

О О

H0 — CH !

I г ,сн, о,сн, о .сн о 4н с=о Йн с вн с-о г Ъ

H0 — C СБ мн

ЯО О но он НО

8. Способ по п. 2, о т л и ч а — ческого комплекса вццеляют фактор F ю шийся тем, что из антибиоти- структурной формулы

О "О.

ОН

Но-Сн а с3 М2

СБ сн,.

С .йН сн р и, о1

Q Q ЯЯ 0 f Q ФQ С 0 и С сн сн сн

ИО- С CH МК

О

ГОПОКТОьил

/"длбмтиО О

Cl Ho

22.11.82 штамм Str. virginiae NRRL

15156

Приоритет по признакам:

24.03.82 штамм Str. virginiae NHRL

12525.

Составитель Г. Смирнова

Редактор О. Юрковецкая Техред M.Ходанич Корректор I1. Пилипенко

Заказ 2242/59 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

° °

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4