Способ консервации периферического нерва

 

Изобретение может быть использовано в нейрохирургии. Цель изобретения - повышение жизнеспособности препарата. Производят инъекцию сосудов нерва раствором, содержащим диметилсульфоксид, глюкозу, гидрокортизон , инсулин и физраствор. Затем помещают препарат в защитную среду с глицерином, сывороткой крови, глюкозой , гидрокортизоном, инсулином и средой 199. Нервы переносят в контейг нер,, заполненный средой того же сост тава. Контейнер герметизируют и помещают в жидкий азот. Использование таких аллонейтротрансплантатов позволит восстановить чувствительность и двигательную функцию в зоне, иннервируемой поврежденным нервом. с (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

С01 1ИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5I) 4 А Ol N 1 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

H АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 39 92746/28-1 4 (22) 17.12.85 (46) 23.05.88. Бюл. 9 19 (71) Киевский государственный институт усовершенствования врачей и Киевский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (72) I0.Á. Чайковский, В.П. Яценко, Г.И. Когут и С.П. Галич (53) 615.475 (088.8) (56) Яценко В.П. Состояние периферического нерва, консервированного в условиях очень низкой тевйтературы, и результаты его трансплантации.

Автореф. дисс. канд. мед. наук.

Киев, 1968. (54) СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕС+

КОГО НЕРВА.Я%„1397014 А1 (57) Изобретение может быть использовано в нейрохирургии. Цель изобретения — повышение жизнеспособности препарата. Производят инъекцию сосудов нерва раствором, содержащим диметилсульфоксид, глюкозу, гидрокортизон, инсулин и физраствор, Затем помещают препарат в защитную среду с глицерином, сывороткой крови, глюкозой, гидрокортизоном, инсулином и средой 199. Нервы переносят в контейнер, заполненный средой того же сос-. тава. Контейнер герметизируют и помещают в жидкий азот. Использование таких аллонейтротрансплантатов позволит восстановить чувствительность и двигательную функцию в зоне, иннервируемой поврежденным нервом.

1 39 7014

Изобретение относится к области медицины и касается кон. ервации тканей.

Цель изобретения — повышение жиз5 неспособности препарата.

Способ осуществляют следующим обр азом.

При строгом соблюдении правил асептики и антисептики осуществляют доступ к артерии, ветви которой кровоснабжают нервные стволы, подлежащие подготовке к аллотрансплантации.

В стенке артерии делают небольшой надрез, через который в ее просвет вводят иглу, соединенную с аппаратом для инъекции жидкостей. Делают надрез стенки лежащей рядом вены. Производят инъекцию выделенной артерии раствором, содержащим, г/л: 20

Диметилсульфоксид 80-120

Глюкоза 45-50

Гидрокортизон 0,05-0,07

Инсулин 50-70 ЕД

Физиологический 25 раствор .До 100,) мл

Этот раствор должен быть охлажден до +4 С. Инъекцию проводят медленно, в течение 10-15 мин, давление во время инъекции, контролируемое маномет- 30 ром, не должно превышать 120 мм рт. ст.

Инъекцию заканчивают при вытекании иэ разреза в вене криозащитной среды беэ примеси крови.

После окончания инъекции артерия 35 и вена дистальнее кончика иглы перевязываются, иглу аппарата извлекают иэ просвета артерии. Время экспозиции раствора в сосудах .нерва составляет

30 мин. 40

С соблюдением асептики и антисептики иссекают инъецированные нервы в течение 10-15 мин и переносят их в криозищитную среду„ содержащую, г/л .

Глицерин 120-180

Сыворотка крови 150-200

Глюкоза 45-50

Гидрокортизон 0 05-0,07

Инсулин 50-70 ЕД

Среда 199 До 1000 мл

Инкубацию в данной среде продоло жают в течение 60-80 мин, при +4 С, после чего нервные стволы переносят в упаковку, заполненную криозащитной средой этого же состава, которую герметизируют и помещают в жидкий о азот при -196 С.

Оценку жизнеспособности нервных стволов производят общеизвестными методами (трансплантация в дефект одноименного аллонерва, трансплантация в межмышечный дефект, культивирование

in vitro, люминесцентная микроскопия, импрегнационные методики, изучение расщипанного нерва в фазовом контрасте и др. (после их быстрого отогревания в водяной бане при +42 С и отмывания криозащитной среды в растворе

Хенкса в течение 30 мин).

Проверку аллотрансплантатов и применяемых для их обработки растворов на стерильность производят согласно инструкции по бактериологическому контролю консервированной крови, ее компонентов, препаратов консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов.

Пример 1. Четырех собак масooé 12-15 кг умерщвляют при помощи внутривенного введения гексенала.

Через 3 ч после гибели животных с помощью аппарата Боброва производят инъекцию задних конечностей через брюшную аорту охлажденной до :.+4 С средой, содержащей 100 r диметилсульфоксида, 47,5 r глюкозы, 0,06 r гидрокортизона, 60 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл.

Через 30 мин иссекают седалищные нервы и инкубируют их в течение

70 мин в охлажденной до +4 С среде, содержащей 150 г глицерина, 175 г сыворотки крови (собачьей), 47,5 г глюкозы, 0,06 r гидрокортизона, 60 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл.

Нервы переносят в контейнер, заполненный средой того же состава.

Контейнер герметизируют и помещают в жидкий азот при †1 С.

Через 4 мес. хранения нервы разо мораживают в водяной бане при +42 С, отмывают в растворе Хенкса в течение

30 мин и их отрезки длиной 6 см трансплантируют в дефект седалищных нервов восьми экспериментальных собак.

Через 1-3 мес. после операции собак-реципиентов забивают и оценивают . жизнеспособность трансплантатов.Результаты исследования сравнивают с результатами, полученными при использовании в качестве трансплантатов нервов, подготовленных к аллотрансплантации по известному методу.

Проведенные исследования показали, чтс аллонейротрансплантаты сохраняют жизнеспособность подавляющего большинства соединительнотканных и

139 701 4 невральных клеточных элементов. Нейролеммоциты трансплантированнь х нервов размножаются не только в периферических, но и в центральных пучках аллотрансплантата. Разрушение предсуществующих нервных волокон по типу валлеровской дегенерации происходит по всей толще консервированного нерва с образованием типичных овоидов.

Консервированный нервный ствол служит активным проводником регенерирующих нервных волокон из центрального отрезка нерва реципиента в периферический. Новообразованные осевые цилиндры уже к концу первого месяца после операции прорастают через толщу трансплантата и в большом количестве проникают в периферический отрезок поврежденного нерва. Количество сохранивших свою жизнеспособность нейролеммоцитов составило 71":1,47.

Проведено сравнение иммуногенности периферических нервов, подготовленных к аллотрансплантации по предлагаемому и известному способам. Изучены реакции регионарных лимфатических узлов и селезенки. Выяснено— максимальное число бластов и наибольшая плотность малых лимфоцитов в паракортикальных зонах лимфатических узлов отмечены через 1-2 мес чосле операции, что позволяет трансплантату нерва длительное время служить проводником регенерирующих аксонов из центрального отрезка поврежденного нерва в периферический.

Пример 2. В опыт берут шесть собак массой 10-12 кг. Передние конечности двух животных через

2 ч после эутаназии инъецируют охлажденным до +4 С стерильным раствоо ром, содержащим 80 г диметилсульфоксида, 45 г глюкозы, 0,05 г гидрокортизона, 50 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл.

Через 30 мин, соблюдая правила асептики и антисептики, в области предплечий иссекают локтевые и срединнь .е нервы и инкубируют их в течение 60 мин в охлажденной до +4 С среде, содержащей 120 г глицерина, 150 r сыворотки кроьи, 45 r глюкозы, 0,05 г гидрокортизона, 50 ЕД инсулина„ среды 199 до 1000 мл.

Нервы переносят в контейнер со средой этого же состава, который

10 тизируют и переносят в жидкий азот

45 при — 196 С.

Через 4 недели хранения образцы с нейротрансплантатами отогревают в водяной бане при +42 С в течение

30 мин, отмывают в растворе Хенкса и

50 отрезки нервов длиной 6 см трансплантируют в дефекты одноименных: нервов четырех собак †реципиент.Последних умерщвляют через 1 мес. и оценивают состояние нейротрансплантатов.

Процессы вторичной дегенерации и невротизации трансплантатов происходят равномерно по всей их толще.

Количество жизнеспособных нейролеммоцитов составило 73+1,17..

40 герметизируют и помещают в жидкий азот при †1 С.

Через 4 недели хранения нервы о отогревают в водяной бане при +42 С, отмывают в растворе Хенкса в течение

30 мин и их отрезки длиной 4 см трансплантируют в экспериментально создаваемые дефекты одноименных нервов четырех собак-реципиентов. Через

1 мес. собак-реципиентов забивают и оценивают состояние нейротрансплантатов.

Пропессы валлеровской дегенерации происходят по периферии и в толше трансплантатoB Последние хорошо реваскулярпзованы, причем новообразованные капилляры проникают в глубоко расположенные пучки ° Регенирурующие осевые цилиндры невротизируют бюнгнеровские ленты трансплантатов, расположенные как в периферических, так и в центральных фасцискулах.

Количество жизнеспособных нейролеммоцитов составило 71+0,97..

Пример 3. В опыт берут шесть собак массой 14-15 кг. Задние конечности двух животных через 4 ч после эутаназии инъецируют охлажденным до +4 С стерильным раствором, о содержащим 120 г диметилсульфоксида, 50 г глюкозы, 0,07 г гидрокортизона, 70 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл. Через 30 мин иссекают мало- и большеберцовые нервы и инкубируют их в течение 80 мин в стерильной охлажденной до +4 С среде, содержащей 180 r глицерина, 200 г сыворотки крови, 50 r глюкозы, 0,07 F гидрокортизона, 70 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл. Нервы переносят в контейнер, заполненный средой этого же состава, который герме1397014

II р и м е р 4. Двух собак умерщвляют при помощи внутрив нного введения гексенала. Через 4 ч после смерти с соблюдением правил асептики и антисептики производят инъекцию их передних конечностей раствором, содержащим 125 г диметилсульфоксида, 50 r глюкозы,,0,08 r гидрокортизона, 75 ЕД инсулина, физиологического 10 раствора до 1000 мл. Через 35 мин иссекают срединные нервы и инкубируют их в течение 85 мин в стерильной охлажденной до +4 С среде, содержащей 185 г глицерина, 205 г сыворотки крови, 50 г глюкозы

0,08 г гидрокортизона, 75 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл. Нервы переносят в упаковку, заполненную средой этого же состава, которую гер- 20 метизируют и помещают в жидкий азот (-196 С).

Через 6 недель хранения аллонейротрансплантаты размораживают в водяНоН бане (+42 С), отмывают в растворе Хенкса в течение 30 мин и трансплантируют в экспериментально созданные дефекты длиной 4 см одноименных нервов четырех собак-реципиентов.

Последних умерщвляют через 1 мес. после операции и оценивают жизнеспособность трансплантатов.

Процессы вторичной дегенерации и невротизации трансплантатов происходят равномерно, по. всей их толще.

Количество жизнеспособных нейролем35 моцитов составило 73+1,9Х.

Установлено, что подготовленные по предлагаемому способу аллонейротрансплантаты могут храниться в сбà- 40 лансированном солевом растворе в течение 2 ч после размораживания без существенного снижения жизнеспособности их клеточных элементов. Этого времени достаточно для подготовки 45 концов поврежденного нерва к анастомозированию с трансплантатом.

Пример 5. Донор Р, 35 лет.

Смерть наступила в результате ишемической болезни сердца. Через 8 ч

40 мин произведена инъекция сосудов

50 правой верхней конечности стерильным раствором, охлажденным до +4 С и содержащим 100 г диметилсульфоксида, 50 r глюкозы,,0,06 г гидрокортизона, 60 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл. Через 30 мин после окончания инъекции с соблюдением асептики и антисептики произведено иссечение в области предплечья отрезков срединного и локтевого нервов длиной 15 см. Последние помещены на 70 мин в охлажденную до 4" С среду, содержащую 150 r глицерина, 150 r сыворотки крови, 50 r глюкозы, 0,06. r гидрокортизона 60 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл. Аллонейротрансплантаты перенесены в упаковки, заполненные средой этого же состава, которые герметизированы и помещены в жидкий азот при †1 С.

Через 11 мес. упаковка, содержащая срединный нерв, была разморожена в водяной бане при +42 С, аллонейротрансплантат отмыт в растворе Хснкса в течение 30 мин и использован для нейропластики дефекта одноименного нерва у больного Л, 25.лет, поступившего в клинику с диагнозом травма ножом в верхней трети правого предплечья, полный перерыв срединного нерва.

На операции был эамещен травматический дефект срединного нерва консервированным по предлагаемому способу трансплантатом одноименного нерва длиной 5 см.

Контрольный осмотр через 1 год после проведения операции выявил восстановление чувствительности в зоне, иннервируемой срединным нервом, до степени S, восстановление функции мышц передней поверхности предплечья до степени М, мышц кисти — до степени М . По данным элект3 ромиографии электрическая активность мышц правого предплечья и кисти достоверно не отличалась от таковой на здоровой конечности. При пробе Минора отмечено полное восстановление потоотделения на пальцах и ладони в области, иннервируемой срединным нервом, что свидетельствует об успешной регенерации срединного нерва.

Подготволенные по предлагаемому способу аллонейротр ансплантаты были использованы для пластики 6 срединных и 3 локтевых нервов у 8 больных.

Величина дефектов нервных стволов составила 5-7 см (у пяти больных) и

10-20 см (у трех больных) . Изучение отдаленных результатов операций показано, что положительный результат получен у шести больных. Два неудовлетвор..гельных результата не связаны с применением предложенного спосо1397014

Формула из об р е те ния

Способ консервации периферического нерва путем помещения в защитную среду, содержащую глицерин, сыворотку крови и среду 199 с последующим замораживанием, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения жизнеспособности препарата, перед помещением в защитную среду производят инъекцию сосудов нерва раствором, Составитель Е.Ярных

Техред Л.Олийнык Корректор А. Тяско

Редактор Е. Папп Заказ 2543/3

Тираж 455 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета .СССР .по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ба, а я вили сь следствием чр езмер но больших дефектов (более 12 см) и грубого рубцового перерождения окружающих тканей до операции.

Использование изобретения поз во- лит восст ановить чувст вительно сть и двигательную функцию в зоне, инервируемой поврежденным нервом. содержащим диметилсульфоксид, глюкозу, гидрокортизон, инсулин, физраст ,вор при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Диметилсульфоксид 80-120

Глюкоз а 45-50

Гидрокортизон 0,05-0,07

Инсулин 50-70 ЕД

Физраствор До 1000 мл, а затем помещают препарат в зжцитную среду, дополнительно содержащую глюкозу, гидрокортизон, инсулин при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Глицерин 120-180

Сыворотка крови 150-200

Глюкоза 45-50

Гидрокортизон 0,05-0,07

20 Инсулин 50-70 ЕД

Среда 199 До 1000 мл