Способ определения каталазы в крови
Изобретение относится к технике определения активности ферментов и может быть использовано в биологических исследованиях, а также в ветеринар но-медици не кой практике. Целью изобретения является повышение точности определения каталазы. Способ включает отбор крови, ее разведение, инкубирование, с перекисью водорода, добавление мета-фосфорной кислоты, фильтрование, в ведение в фильтрат раствора восстановленного глутатиона и хро могенного реактива следующего состава, об.%: 4%-ный водный раствор молибденовокислого аммония 45-50J ледяная уксусная кислота 20%- ньй водный раствор силиката натрия 2-4; вода-остальное,с последующим колориметрированием полученной смеси . 4 табл. с S (Л
СОЮЗ СОВЕТСНИХ соцИАлистичесних
РЕСПУбЛИН (19) (11) А1 (5И 4 G 01 N 33/48
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТН1Ъ1ТИЙ (21) 3924459/30-13 (22) 02.07.85 (46) 30.05.88. Бюл. N- 20 (75) В.И. Дудин (53) 577.15.08(088.8) (56) Крайнев С.И. Методика параллельного определения каталазной активности интактных эритроцитов, активности и каталитической емкости гемолизата в одном образце крови. — Лабораторное дело, 1967, Р 9, с.562-563.
Асатиани В.С. Ферментные методы анализа: Наука, 1969, с. 611-612. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТАЛАЗЫ В
КРОВИ (57) Изобретение относится к технике определения активности ферментов и
-может быть использовано в биологических исследованиях, а также в ветеринарно-медицинской практике. Целью изобретения является повьппение точности определения каталазы. Способ включает отбор крови, ее разведение, инкубирование, с перекисью водорода, добавление мета-фосфорной кислоты, фильтрование, введение в фильтрат раствора восстановленного глутатиона и хромогенного реактива следующего состава, об.7: 4Е-ный водный раствор молибденовокислого аммония 45-50
Э ледяная уксусная кислота 20 25;20Хный водный раствор силиката натрия
2-4; вода-остальное, с последукицим колориметрированием полученной смеси. 4 табл.
1399682
20-25
Изобретение относится к технике определения активности ферментов и может быть использовано в биологических исследованиях, а также в ветеринарно-медицинской практике.
Целью изобретения является повышение точности определения каталазы.
Для определения каталазы готовят образец, инкубируют его с перекисью 10 водорода, определяют неиспользованную перекись водорода. Последнюю операцию проводят путем добавления в инкубационную среду 10%-ного водного раствора мета-фосфорной кислоты,15 фильтрования, приливания к фильтрату
0,4%-ного водного раствора восстановленного глутатиона и колориметрирования смеси после добавления хромогенного реагента следующего со- 20 става, об.%:
4%-ный водный раствор молибденовокислого аммония ((NH,,)6 "o 0«4HO) 45-50 25
Ледяная уксусная кислота
20%.-ный водный рас,твор силиката натрия (NaqBiO 9H O) 2-4 30
Вода 21-33
Колориметрируемая смесь состоит из, об.%:
Инкубационная смесь (+вода), содержащая
0-3 мкМ перекиси водорода 10-4 7
10Х-ный водный рас-твор мета-фосфорной кислоты 8- I 5
0,4Х-ный водный рас" твор восстановленного глутатиона 5-15
Хромогенный реагент 40-60
Пример. 1 мл разведенной в
2500 раз гемолизированной крови поросят переносят в пробирку и нагрео вают на водяной бане при 37 С в течение 3 мин, а затем добавляют 1 мл
3 мМ раствора перекиси водорода, подогретого до 37 С, Через 1 мин реакцию останавливают приливанием 1 мл
10%-ного раствора мета-фосфорной кислоты. Фильтруют, к 1,5 мл фильтрата приливают 0,5 мл 0,4Х-ного Раствора восстановленного глутатиона, а затем — 3 мл хромогенного реагента.
Спустя I- 12 ч пробу колориметрируют при 650-700 нм. Параллельно ставят слепую пробу (вместо 1 мл перекиси водорода — 1 мл воды). Количество перекиси водорода определяют по предварительно построенному калибровоч" ному графику, который при концентрациях перекиси водорода от 0 до 3 мкМ представляет собой прямую линию.
В целях приготовления хромогенного реагента к 50 мл 4% †но водного раствора молибденовокислого аммония ((NH<) NO 0 „° 4Н О) приливают 25 мл ледяной уксусной кислоты, а затем, после тщательного перемешивания, добавляют 3 мл 20%-ного водного раствора силиката натрия (11а БхО 9Н О) и водой доводят до
100 мл.
Активносгь каталазы рассчитывают по формуле
А = К(Си Сн)s где А — активность, мкМ Н О /минюмл крови;
C„ - исходное количество Н О мкМ (С,„=З),.
С „ — количество неиспользованной
Н О, мкМ, R - разведение крови (R=2500)
В табл.1 представлены сравнительные данные определения перекиси водорода, добавленной в инкубационную среду, включающую препарат гемолизо". ванной крови поросят, который предварительно инактивировали кипячением.
По сравнению с известным предлагаемый способ более точен, он имеет также лучшую повторяемость результатов.
В табл. 2 представлены данные по определению пределов состава хромогенного реагента.
В табл. 3 приведено определение пределов состава колориметрируемой смеси.
В табл. 4 представлены данные по изучению пределов концентрации перекиси водорода в инкубационной среде.
Формула изобретения
Способ определения каталазы в кро" ви, включающий отбор крови, ее разведение, инкубирование с перекисью водорода, определение количества непрореагировавшей перекиси водорода, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности определения, в инкубационную среду добавляют раствор з 1399682 мета-фосфорной кислоты, смесь фильтруют и к фильтрату добавляют раствор восстановленного глутатиона и хромогенный реактив следукщего состава, об.X:
4Еный водный раствор молибденовокислого
45-50
20-25
2-4
Остальное
Таблица 1
Известный
Предлагаемый
Фактическое со7 отклонения от фак тического
Найдено Ж отклонеН О.,мкМ ния от фак тического
Разница между парал., 7.
Разница между паpGJI 4) 7CI держание
Н 0,мкМ содержания содержания
27,0
5,7 1,7
1,73
1,70
5,4
20,0
2,16
3.3
1,86
1,80
1,8
25,9
2,23
2,0
1,89
1,85
1,90
3,9
15,8
2,20
1,7
1,94
2,1
2,07
1,6
25,9
2,48
3,5
2,00
21,7
2,0, 2,47
0,2
2, 13
2,05
15,9
2,0
2,47
2,16
2 ° 8
2, 10
1,6
13,0
2,52
2,26
2,20
9,2
1,0
2,48
2,27
1,3
2,30. 19,5.
5,1
2,75
0,8
2,35
2,33
Среднее
19,4
3,0
0 5
2,4
Та блица 2
Сост as компонентов
Содержание компонентов в смеси об,g
1 2 3 4 5 6
Аммоний молибденовокислый,4Ж-ный водный раствор
30 35
40
50
25 25
25 25
Кислота уксусная, ледяная,Силикат натрия, 20Х-ный водный раствор аммония
Ледяная уксусная кислота
207-ный водный раствор силиката натрия
Вода
Найдено
Н 0,мкМ
2,16
1399682
Продолжение табл.2
Состав компонентов
I вода
42 37
22
81,3
100
50
50 50
50
10 15
30
3 3
37 32
22
Выпадение осадка
50 50
50
25 25
25
2 3.
23 22
24
Вода
53 3 96 1 100
Таблица 3
Состав компонентов
20
20
10 15
5 о
Определено перекиси водорода,%
Аммоний молибденово, кислый, 4%-ный водный ! раствор !
Кислота уксусная, ледяная
Силикат натрия, 20%-ный
1 водный раствор
: Вода
Определено перекиси водорода,%
Аммоний молибденовокислый, 4%-ный водный раствор
Кислота уксусная, ледяная
Силикат натрия, 20%-ный водный раствор
Определено перекиси водорода,X
Инкубационная среда
Мета-фосфорная кислота 10%-ный водный
1 раствор
Содержание компонентов в смеси, об.Х
2 3 4 5 б
89,5 94,1 96,9 98,7
69,9 84,4 93,2 98,2 100
942 913 873
Содержание компонентов .в смеси, об.%
1 2 3 4 5
1399682
Состав компонентов
10
10
50
50
50
12
Вода
О.
96,7
87,6
100,0 98,1
95 2
20
20
10
10
10
20
50
50
10
Вода
17,5
83,3 97,2
20 20 й
20
10
10
1.0!
10
10
10.
20
60
Вода
30
10
88,8
95,7
97,7
Глутатион восстановленный, 0,4%-ный водный раствор
Хромогенный реагент
Определено перекиси водорода,%
Инкубационная среда
Мета-фосфорная кислота, 10%-водный раствор
Глутатион восстановленный, 0,4%-ный водный раствор
Хромогенный реагент
Определение перекиси водорода,%
Инкубационная среда
Мета-фосфорная кис. лота, 10%-ный водный раствор
Глутатион восстановлен-. ный, 0 ° 4%-ный водный раствор
Хромогенный реагент
Определено перекиси водорода,%
Hp од олжени е табл. 3 !
Содержание компонентов .в смеси, об.Х
2 3 :4 $
100,0 97,4 96,4
100 0 99,6
\! 399682
Таблица 4
Концентрация перекиси водорода, мкм
1,0 1,5 2,0 3,0 4,0
0 5
Отклонение от линейной зависимости,X
6,0 10,7
Составитель И. Tapeesa
Техред А.Кравчук Корректор М. Демчик
Редактор М. Бандура
Заказ 2662/46
Тираж 847 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, 11осква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
