Способ определения микроколичеств белка в растворах, содержащих детергенты

 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может найти применение в любых исследованиях , требующих определения микроколичеств белка. Целью изобретения является повышение точности и сокращение времени проведения анализа. Для этого после денатурации белка кислотой образующийся осадок детергентов растворяют 25-30%-ным этанолом, белок собирают на фильтрах, окрашивают амидочерным 10Б, элюируют окрашенный комплекс и определяют оптическую плотность раствора при 630 нм. 2 ил., 3 табл. S ; 0

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1404949 А 1 (51)4 С 01 N 33/48 15/06

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

«31

Н А BTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИИКРОКОЛИЧЕСТВ БЕЛКА В РАСТВОРАХ, СОДЕРЖАЩИХ

ДЕТЕРГЕНТЫ (57) Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может найти применение в любьи исследованиях, требующих определения микроколичеств белка. Целью изобретения . является повьппение точности и сокращение времени проведения анализа. Для этого после денатурации белка кислотой образующийся осадок детергентов растворяют 25-ЗОХ-ным этанолом, белок собирают на фильтрах, окрашивают амидочерным 10Б, элюируют окрашенный комплекс и определяют оптическую плотность раствора при 630 нм. 2 ил., 3 табл. (21) 4066164/31-13 (22) 06.05.86 (46) 23.06.88. Бюл. К 23 (71) Институт биологической физики

АН СССР (72) Н.П.Сирота и Т.В.Сирота (53) 543.855(088.8) (56) Schaffner W. and Weissman С.

A rapid, sensitive and specific

method for the determination of protein in dilite solution.- Analytical

Biochemistry, 1973, v. 56, р. 502514.

Mcknight G. А colorimetric method

for the determination of subricrogram quantities of protein. — Analytical Biochemistry. 1977, v.. 78, р. 86-92.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1404949

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может найти применение в любых исследованиях, требующих определения микроколичеств белка.

Цель изобретения — повышение точности анализа и сокращение времени определения белка в растворах, содержащих детергент. 1Р

Изобретение заключается в том, что проводят кислотную денатурацию белка, нанесение его на фильтр, окрашивание специфическим красителем, элюцию окрашенного комплекса с последующим колориметрированием, согласно предлагаемому способу образующийся при кислотной денатурации белка осадок детергентов растворяют этанолом в концентрации 25-30Х, после чего белок 20 собирают на фильтре.

Подобранная концентрация этанола (25-307) растворяет осадки детергентов и не влияет на точность определения количества белка. Концентрация 25 этанола менее 257 не растворяет кислотонерастворимые осадки амфифильных соединений, концентрация этанола больше 307. нарушает структуру фильтра, что приводит к искажению результата, Так как белок собирают на фильтре путем фильтрации, а не за счет поглотительной способности фильтра, то объем пробы, содержащей белок, не ограничен. Минимальное количество определяемого белка 0,5 мкг в любом объеме пробы.

На фиг.1 представлен график зависимости влияния различных концентраций этанола на точность определения 40 белка; на фиг.2 — результаты построения калибровочных кривых.

Точность (фиг.1) представляют как достоверное определение количеств белка в образце относительно стандар- 45 та (в качестве стандартного раствора используют раствор бычьего сывороточного альбумина) независимо от присутствующих агентов (различные концентрации и типы амфифильных соединений, этанол) ° Количество белка в пробе

50 (стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина) составляет 10 мкг.

Из результатов, представленных на графике, следует, что этанол в концентрации 25-30Х не влияет на точность определения количества белка в пробе относительно стандарта. При увеличении концентрации этанола выше

307. определяемое количество белка в пробе занижается.

Результаты построения калибровочных кривых (фиг.2) представляют зависимость поглощения окрашенного комплекса при Л = 630 нм от количества белка в пробе для стандартного раствора бычьего сывороточного альбумина в присутствии различных детергентов (17-ный тритон Х-100, 17-ный саркозилат натрия, 17-ный цетавлон) и 257ного этанола. Из представленных результатов следует, что, используя предлагаемый способ, можно достоверно определять микроколичества белка в присутствии детергентов относительно стандартного раствора белка.

Пример 1. Определение концентрации бычьего сывороточного альбумина в стандартном растворе, содержащем 1X-ный тритон Х-100.

Берут 10 мкл раствора белка концентрации 1 мг в 1 мл и вносят в

2 мл iX†- ного раствора тритона Х-100.

Затем добавляют 0,5 мл 507.-ного ТХУ.

Для удаления образующегося осадка через 2 мин в пробу вносят 0,8 мп абсолютного этанола (конечная концентрация этанола 25X). Осадок амфильного соединения исчезает и раствор фильтруют через мембранный фильтр

SYNP0R Ф 6, предварительно промытый раствором, содержащим 57.-ный ТХУ и

257-ный этанол, После нанесения образца фильтр промывают дважды 2 мл раствора 57-ного ТХУ + 25X-ный этанол, Далее фильтр нанизывают на нержавеющую проволочку и погружают для окрашивания в раствор амидочерного

10 Б (О, 17-ный амидочерный 10 Б в

cMecii метанол:ледяная уксусная кислота:Н О = 45:10:45). Через 3 мин фильтр ополаскивают дистиллированной

Н О (30 с), трижды по 1 мин в растворе метанол:ледяная уксусная кислота:Н О = 90:2:8 и в течение 2 мин в дистиллированной H 0. Фильтр подсушивают фильтровальной бумагой, помещают в пробирки и заливают 2 мл элюирующего раствора (25 мМ NaOH, 0,05 мМ

ЭДТА в 507.-ном этаноле). Через 10 мин окрашенный элюирующий раствор колориметрировали при длине волны

= 630 нм.

Аналогичные процедуры проводят с контрольным фильтром, на который наносят контрольную пробу, не содержащую белок. Окрашивание и промывку

1404949 концентрации 257. растворяет осадок амфифильного соединения, образующийся при взаимодействии тритона Х-100 (который содержится в образцах раствора

5 белка) с ТХУ и, как видно из табл. не влияет на точность определения количеств белка в пробе.

Таблица 1

Опыт II (+1Xный тритон Х-100 и +257.-ный этанол) Количество Контроль Опыт I белка в про- (нет этанола (+25X-ный бе, мкг и тритона этанол)

Х-100) 2 0,025+0,001 0,024+0, 002 0,026+0,001

4 О, 051+0, 002 О, 053+0, 001 О, 050+0, 002

10 О, 131+0,002 О, 125+0, 003 О, 132+0,001

20 0,245+0,003 0,251+0,002 0,247+0,004

В контрольных пробах (отсутствует тритон Х-100 и 257-ный этанол) и опытных (присутствует тритон Х-100 и 257.-ный этанол или только 257-ный этанол) достоверно определяется идентичное количество белка.

Таким образом, используя 257-ный этанол, можно достоверно (точно) опФ ределять микроколичества белка в присутствии тритона Х-100. Время проведения процедуры определения белка 35 составляет 25 мин.

Пример 2. Определение концентрации белка в суспензии клеток.

100 мкл лизата суспензии клеток асцита Эрлиха, получаемого путем 40 растворения клеток (1,Оба 10 клеток в 2 мл раствора, содержащего 8 M мо° чевину, детергент (17-ный саркозилат натрия в 10 мМ фосфатном буфере), вносят в 2,4 мп 107.-ный ТХУ.

Далее процедуры определения количеств белка ведут как в примере 1, только используемая концентрация этанола 277.

В результате проведенных исследо- 50 ваний показано, что этанол в концентрации 277 растворяет осадок амфифильных соединений, образующийся при обработке пробы, белка ТХУ, и, следовательно, появляется возможность опре- 55 делить концентрацию белка в лизате суспензии клеток. В качестве стандартного раствора белка используют бычий контрольного фильтра проводят одновременно с опытным фильтром, содержащим белок. Опытный и контрольный фильтры нанизывают на одну проволочку и разделят друг от друга стеклянной бусинкой.

В результате проведенных исследований быпо показано, что этанол в сывороточный альбумин, растворенный в растворе, содержащем 8 M мочевину, 17-ный саркозилат натрия в 10 мИ фосфатном буфере.

100 мкл лизата суспензии клеток содержат 24 мкг белка. Таким образом, согласно предлагаемому способу, проведено определение концентрации белка в лизате суспензии клеток. Время проведения анализа 25 мин.

П р и и е р 3. Определение концентрации белка в суспензии клеток.

Условия выполнения процедуры определения белка как в примерах i и 2, только в качестве детергентов для получения лизата клеток используют 17.ный цетавлон в присутствии 8 M мочевины и 10 MM фосфатного буфера и для удаления осадков амфифильного соединения применяют этанол в концентрации 307.

В результате проведенных исследований показано, что для устранения кислотонерастворимого осадка амфифильного соединения, образующегося после обработки пробы белка ТХУ, применима 307-ная концентрация этанола.

Определено, что 100 мкл лизата суспензии клеток содержат 24 мкг белка.

Таким образом, появляется возможность определить микроколичество белка в лизате клеток асцита Эрлиха. Время проведения анализа 25 мин.

1404949

Таблица3

Время проведения эксперимента, мин, по способу

Операции способа (на 10 проб белка) известный предлагаемый

Т а б л и ц а 2

Нанесение проб белка на фильтры

Точность измерения, 7 по отношению

10-30 (4 С) 2 о (t комн.) Фиксация ТХУ к контролю

Окрашивание красителем

Отмывка не связав20

Известный

Тритон Х-100

Додецилсульфат натрия способ

1 Не влияет

5,2

1 Занижение ре20 зультатов .на 50Х

1 Занижение зультатов

207.

1 Занижение зультатов на 207

Саркозилат ре10 на

25 реДезоксихолат (ДОХ) 15

1,5-2 ч

Цетавлон

О, 1-1

0,1 — 1

Саркозилат.

8 M

Мочевина

Данные, доказывающие положительный эффект предлагаемого способа, сведены в табл. 2 и 3. В табп. 2 представлены результаты характеризующие влиУ 5 яние детергентов на точность определения концентрации белка.

Амфифильные соеди- Коннения в образцах центбелка рация, X.

Предлагаемый способ

Тритон Х-100 0,4-1 Не влияет 30

Как видно из табл. 2, в предлагаемом способе детергенты не влияют на точность определения концентрации

40 белка, т. е. сравнение контрольных проб (не содержат амфифильных соединений) с пробами, содержащими амфифильные соединения, дает идентичные результаты.

В табл ° 3 представлено сравнение времени проведения эксперимента по определению концентрации белка согласно известному и предлагаемому способам для 10 образцов белка. шегося красителя общая индивидуальная

Вырезание окрашенного пятная

Элюция окрашенного комплекса

Центрифугирование (уравновешивание, центрифугирование и т.д.)

Подкисление супернатанта

Итого:

П р и м е ч а н и е. (-) — операция отсутствует.

Как следует из табл. 3, в предлагаемом способе процедура определения белка сокращается в 3-4 раза по сравнению с известным.

Формула изобретения, Способ определения микроколичеств белка в растворах, содержащих детергенты, включающий кислотйую денатурацию белка, нанесение его на фильтр, окрашивание специфическим красителем, элюцию окрашенного комплекса и последующее колориметрирование, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени проведения анализа, образующийся в кислой среде осадок детергентов растворяют этанолом в концентрации

25...30X.

1404949

0,20

О,ОЧ

1б

so ю

3таиол, ©/е

В Р2.

Белок,икг

4ьа2 кончала

25 7е злуянОЯ

1 . цева8лон

t % саркомиаа

1% ЩзийоиХ-%