Способ получения красителя для определения активности фермента

 

Изобретение касается производства красителей, в частности, для биохимических исследований. Синтез красителя ведут азосочетанием производного нафтиламина и соли диазония общих ф-л I и II , где R-моно- или диалкильная аминогруппа, пиперидил, морфолил: группа [R-N=N⊝] представляет а) ; б) ; в) ; г) ; д) ; е) ; Y-BE^⊝₄; Cl⊝·1.2 ZnCl₂; 1/2SO^⊝₄. Новые соединения позволяют определить трипсин в сравнении с 1-(карбобензоксиаргинил)аминонафталин-5-сульфокислотой в 8,3 раз точнее за счет лучшей их чувствительности. Кроме того, они улучшают кинетические характеристики хромогенных субстратов при определении сериновых протеаз в сравнении с известным. 4 табл.

Изобретение относится к химии азокрасителей, конкретно к способам получения новой смеси красителей, которые используют для биохимических исследований, а именно для определения активности фермента. Краситель имеет общую формулу где R - моно- иди дизамещенная низшим алкилом аминогруппа, пиперидил, морфолин. Целью изобретения является улучшение качества красителя, использование которого позволит улучшить кинетические характеристики хромогенных субстратов. Изобретение иллюстрируется примерами. П р и м е р 1. Синтез красителей. 1-Амино-2(4)-(4'-нитрофенилазо) нафталин-5-(N'', N'диметил)сульфамид. К раствору 2,5 г (10 моль) 1-аминонафталин-5-(N', N'-диметил)сульфамида в 125 мл бутанола добавляют раствор 2,5 г (10,5 ммоль) борфторида 4-нитрофенилдиазония в 140 мл 40% -ного водного этанола, перемешивают 30 мин, добавляют 400 мл воды и 400 мл этилацетата, водный слой дополнительно экстрагируют этилацетатом и отбрасывают, объединенные органические вытяжки промывают водой и упаривают при пониженном давлении. Получают 4 г (90% ) красителя в виде темнокрасного мелкокристаллического порошка. Аналогично получают и другие красители. Поскольку характер выполняемых операций при этом не меняется, примеры сведены в табл. 3. В табл. 2 приведены кинематические характеристики хромогенных субстратов в зависимости от использования известного и предложенного субстратов. П р и м е р 2. Разделение смеси изомеров красителей хроматографией на силикагеле. 50 мг смеси изомеров 1-амино-2(4)-(4'-нитрофенилазо)нафталин-5-(N''-бутил)сульфамида растворяют в 5 мл смеси этилацетат - гексан (2: 1), наносят на колонку с силикагелем и элюируют сначала той же смесью, а затем этилацетатом. Окрашенные зоны собирают раздельно и упаривают в вакууме. Порядок выхода отдельных изомеров приведен в табл. 1. Аналогично могут быть разделены смеси изомеров и других красителей. П р и м е р 3. К 1 мл термостатированного при 37^оС 1 мм раствора 1-(тозилглицил-1-пропил-1-аргинил) аминонафталин-5-(N', N'-пентаметилен)сульфамида в 0,05 М трис-НСl буфере (рН 8,2) добавляют 5 мкл исследуемого препарата фермента, перемешивают встряхиванием, инкубируют 20 мин при 37^оС, добавляют 1 мл 2 мМ раствора 4-нитрофенилдиазония в 1 М уксусной кислоте, перемешивают и через 5 мин определяют оптическую плотность раствора красителя N 12 (табл. 3) при 500 нм. Содержание фермента определяют по калибровочной кривой зависимости оптической плотности при 500 нм от содержания стандартного раствора фермента. Пробу, обработанную, как в примере 3, после инкубации в течение 20 мин при 37^оС, добавления диазосоли и перемешивания экстрагируют 2 мл этилацетата, центрифугируют, этилацетатный слой отделяют автоматической пипеткой, упаривают и фотометрируют. Сравнение чувствительности определения трипсина при использовании предложенного и известного красителей, дано в табл. 2. Свойства полученных азокрасителей по сравнению с известным приведены в табл. 4. Таким образом, предложенные красители повышают чувствительность определения трипсина в 8,3 раза по сравнению с известным, а также улучшают кинетические характеристики хромогенных субстратов при определении сериновых протеаз в сравнении с известным. (56) Авторское свидетельство СССР N 1278361, кл. C 12 Q 1/00, 1984.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРАСИТЕЛЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА реакцией азосочетания производного нафтиламина и соли диазония, отличающийся тем, что, с целью повышения качества красителя, в качестве производного нафтиламина используют 1-аминонафталин-5-сульфамид общей формулы где R - моно- или дизамещенная низшим алкилом аминогруппа, пиперидил, морфолил, а в качестве диазосоставляющей - соль арилдиазония общей формулы RNN⁺ Y^-, где RNN⁺-NNNN-/ ; -/
, HO-NN·1/2SO₄/
O₂NNN-;
Y - BF₄, Cl · 1/2 ZnCl₂.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 02.07.1995

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2002

Извещение опубликовано: 27.12.2002        

---