Способ получения изоцитратдегидрогеназы

 

Изобретение относится к биотехнологии . С целью удешевления процес-- са осуществляют культивирование продуцента штамма Pseudomonas putida АТСС 17633 на питательной среде до максимальной активности, отделение клетО;:, получение бесклеточного экстракта , фракционирование сульфатом аммония до 40-50% насьщения, Хромйтографическую очистку полученного экстракта ведут на 10-карбоксидецилсефарозе. Способ предусматривает использование в качестве источника углерода веществ, у которых в процессе окисления образуются ацетоацетаты, которые при регулируемом снабжении кислородом потребляют НАДН и тем самым , регенерируют НАД . Активность фермента в грубом экстракте 1-3 ИЕ/мг, посс ле очистки достигает 50 ИЕ/мг 1 з.п. ф-лы, 2 табл. (Л

СОЮЗ С0ВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1418338 А1 (Ю 4 С 12 М 9/04//(С !2 N 9/04 С ?2 g 1 40) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMMTET СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (89) DD 211933 (48) 25.07.84 (21) 7772758/28-13 (22) 14. 12. 82 (31) MP С 12 D/237648 (32) 24.02.82 (33) DD (46) 23.08.88. Бюл. № 31 (71) Лейпцигский университет им.Карла Иаркса (DD) (72) Шепп Вульфдитер, Таухерт Герман и Груно Марлис (DD) (53) 577.15(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии. С целью удешевления процесса осуществляют культивирование продуцента штамма Pseudomonas putida

АТСС 17633 на питательной среде до максимальной активности, отделение клетбк, получение бесклеточного экстракта, фракционирование сульфатом аммония до 40-50Ж насьицения. Хроматографическую очистку полученного экстракта ведут на 10-карбоксидецилсефа" розе. Способ предусматривает использование в качестве источника углерода веществ, у которых в процессе окисления образуются ацетоацетаты, которые при регулируемом снабжении кислородом потребляют НАДН и тем самым регенерируют НАД . Активность фермен+ та в грубом экстракте 1-3 ИЕ/мг, посЮ ле очистки достигает 50 ИЕ/мг 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1418338

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения изоцитратдегидрогеназы, которая находит применение в клинико-химической диаг5 ностике и в анализе продуктов питания для количественного определения изоцитрата.

Известен способ получения изацит" ратдегидрогеназы из Escherichia coli, 10 предусматривающий культивирование продуцента на питательной среде с последующими выделением и многостадийной хроматографической очисткой целевого продукта. На иммобилизованном текстильном красителе С Ьасгоп В1ие

F3G-A. Активность целевого продукта до 1,2 ИЕ/мг Gesrza(Masgucz В, Reeves Н.С. Biochem Biophys. Acta, v. 578, р. 31-40, 1979).

Недостатки известного способа— многостадийность хроматографической очистки и использование патогенного

20.,продуцента.

Цель изобретения — удешевление про- .5 цесса..

Поставленная цель достигается использованием в качестве продуцента штамма Pseudomonas putida АТСС 17633, ранее известного как продуцент 3-гид- 30 роксибутиратдегидрогеназы (хозяйст венный патент ГДР Р 149874, -кл. С 12 N 9/04, 1980). Культивирование штамма осуществляют преимущественно на 2Х-ном агао 35 ре при 4 С в темноте и использовании в качестве источника углерода декана и сульфата аммония в качестве источника азота.

Культивирование Pseudomonas putida 40 АТСС 17633 осуществляют после заражения посевной культурой при температуре 20-40 С (преимущественно при 30 С) в субмерсионной.культуре на жидкой минимальной среда. 45

Выращивание проводят в условиях такого газового состава воздуха, при .котором образование иэоцитратдегидрогеназы не подавляется избытком внутриклеточного НАДН. Так как это характерно как в случае начального роста, так и при достижении стационарной фазы, активность фермента показывает острый максимум, который достигается в конце логарифмической фазы роста.

Такое развитие имеет место при применении всех источников углерода, которые штамм в состоянии использовать, Абсолютные значения, которые могут быть дОстигнуты в максимуме для ак тивности фермента, находятся в зависимости как От газовых условий, так и от источника углерода. Особенно приемлемыми являются такие вещества, у которых в процессе окисления возникает большое число таких промежуточ" ных продуктов, как ацетоацетат, которые при ограниченном снабжении кислородом в их дальнейших реакциях потребляют НАДН и тем самым регенериру+ ют НАД . Пример таких веществ представлен в табл, 1.

Культивирование проводят на косом агаре, причем источ;ики углерода добавляют в концентрации по 0,57. каждый. После инкубации 24 ч при 30 С бактерии смывают. Активность определяют после замораживания-оттаивания клеток в присутствии 0,1Z тритона

Х 100.

Специфическая активность изоцитратдегидрогеназы в грубом экстракте из Pseudomonas putida АТСС 17633 по-, сле роста на различных источниках углерода приведена н табл. 1.

В качестве источников азота испОльзуют NH4C1 (NH4) gS04 и т,п, По истечении времени роста 5-40 ч в зависимостй от физиологического состояния и количества заражаемого материала бактерии собирают центрифугированием, промывают фосфатным буфером с получением бесклеточного экстракта.

Содержащийся в бесклеточном грубом экстракте фермент показывает в зависимости от источника углерода представленные в табл. 1 специфические активности. Речь идет при этом об эмерсионном культивировании на

2Х-ном агаре. При субмерсионных условиях культивирования такие значения активности достигаются после соответствующего оптимирования газового состава и скорости перемешивания в зависимости от конструкционных параметров ферментационного сосуда. Особенно хорошие результаты достигались тогда, когда культивирование проводилось при применении углеводородов в качестве источников углерода, которые подводились к ферментационному сосуду в -азообразном состоянии. Из бесклеточного грубогс белкового экстракта изоцитратдегидрогеназу выделяют фракционированным осаждением солями или экстракцией сульфатом аммония 5-

14 I 8338

10 раз. Для этого к грубому белковому экстракту добавляется твердый сульфат .аммония до конечной концентрации в

70 насьпцения, причем вся активность переходит в осадок. Для дальне»»шего обогашения изоцитратдегидрогеназы остаток перемешивается каждые 5 икн с раствором сульфата аммония, содержащего 0,05 моль/л МаН РО при 0 С о, и снижающихся концентрациях сульфата аммония. Фермент растворяется прк этом B возрастаюшей степени. Основное количество растворяется при этом

B промежутке концентрацкй сульфата аммония между 40 и 50 насыщения.

Фермент снова осаждают добавлением сульфата аммония до конечной ко гцентрации в 70 .

Предлагаемый фермент хорошо сохраняется. При специфической активности

5-10 ммоль/мкн/мг белка установлено не более следующих чужеродных активностеи: алкоголь-, малат- и лактатдегидрогеназы, каждая менее 1 . Изоцктратдег»»дрогеназа пр»» пр»»»енении гидрофобной хроматографии на 10-карбоксидецилсефарозе может б»пть обогащена до специфической активности в

50 ИЕ/мг. Пример. Культивирование Pseudomonas р»» Ма АТОС 17633 проводят в среде, содержащей на 1 л следующис ингредиенты: К НРО 7,46 г/л; NaH POy

0,54 г/л; MgSO4 7>IZO 20 иг; Са01 2 2Н О 20 мг; Fe(NHg) 2(SOg) g 6H O

10 мг.

В качестве источника азота служит (NH4) gSOg — 1 г/л.

Для эмер конного культивирования штамма в пробирке с косым 2 -ным агаром (Дифко- гар) агар готовят на ос— нове описанной среды. В пробирку вносят 6 ил раствора агара. ЗатвердеваЕ»ие агара осуществляют в максимально возможном горизонтальном положении пробирок. Для поддержания штамма пробирки после пересева на поверхность с помощью петли ставят вертикально.

Затем добавляют 0,1 мл декана, причем поверхность геля только в основании сосуда приходит в соприкосновение с источником углерода.

После кнкубацкк при 25 С в течение приблизительно 60 ч бактерии смывают с поверхности arapa 2 мл 0,05 N фосфатного буфера рН 7,5 (Е, см 2,5) и применяют для заражения субмерсионной культурь»,- Плотность посевного матерка.»а Е,„см. 0,65. Пр .. ".»ьтивировании на углеводородах, например на гексане, источник углерода подают через газовую среду. В 10-литровом фериентативном сосуде с наполнением до 7 л пос-..упление газовой смеси (210 л/ч) осуществляют через содержао щую гекса»» промывную склянку при 30 С.

Среднее поступление гексана в ферментационньп» сосуд при этих услоьиях составляет скоко 5-!О мл/ч. Культуральная среда »»нтенсивно перемешивается (800 об/мин), После культивирования в геченке 25 прк 30"С

Э мутность среды составляет после это,» го Е,,„см "-, бакперик собирают посредством центр»»фугирова шя, промывают фосфатныи буфером 0,05 и/л рН 7,5 и разрушают с noìoùüþ ультразвука прк 4 С. Бесклеточньп» грубый экстракт полу ..ают центрифуг» .рованием.

Специфическая активность изоцктратдегидрогеназы nðè этих условиях достигает значе;п»й 2 ПЕ/мг. Этот белковый грубый экстракт разводят 0,05 м/л фос фатным буферои рП 8 до достижения содержания белка 20 иг/мл. Из этого раствора при 4 С путем добавления сульфата аммония до конечной концентрацпк в 70 насьпцения осаждают основную час-ь бг-: ка.

Общая активность изоцитратдегидрогеназы находится в осадке. После . центркфугпрованкя осадок суспенди"5 о

"5 руют прк 0 С в растворе сульфата аммония (40 . нась»щения) в 0,05 M NaHPO< и центрифугируют, После повторения процедур»п свыше 80 . общей активности

40 изоцктратдегидрогеназы находится в супернатанте (табл. 2) .

Результаты обо» ап;ения изоцитратдегидрогеназы из Pseudomonas putida посредством зкстракции сульфатом аммония, приведены в табл. 2.

Фермент снова осаждают путем до бавления сульфата аммония до конечной концентрации в 70Х нась»п»ения.

Полученный посредством экстракцкк::

50 сульфата аьп»ония сукернатант (супер; натант 2) в количестве 15 мл с содержанием белка в 130 мг наносят на колонку, содержащую 80 мл 10-карбоксидецклсефарозы и элюйруют при

55.

22" С 200 мп раствора сульфата аммония (насьпцение в 40 ) . Получают изоцитратдегидрогеназу, обогащенную до специфической активности в 50 .

ИЕ/мг.

14 I 8338

Формула из обретения

Таблица

Оптическая Активность плотность, фермента, .

Ебоо MMo b/мин/мг

Источник углерода I . Способ получения изоцитратдегидрогеназы, предусматривающий аэробное культивирование продуцента при оптимальной температуре для биосинтеза фермента на питательной среде, содержащей источники углерода, факторы роста и минеральные соли, до максималь- 1р ного накопления активности, отделение клеток; приготовление бесклеточного экстракта, фракционирование сульфатом . аммония и последующую хроматографическую очистку полученного белкового 15 экстракта, о т л и ч а ю щ и и с.я тем, что, с целью удешевления процес-са, в качестве продуцента используют штамм Pseudomonas putida АТСС 17633, фракционирование сульфатом аммония 2р ведут до насыщения 40-507., а хроматографическую очистку осуществляют на

10-карбоксидецилсефарозе.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве ис- 25 точника углерода используют цитрат, изоцитрат, o(--кетоглутарат, фумарат, сукцинат, пируват, D, L-малат, лейцин, глутарат, гексан или декан.

0,8

Цитрат

Изоцитрат

1,2

1,0

0,7 ю(-Кетоглутарат

3,0

t 5

Фумарат

Сукцинат

Цируват

1,2

0,7

3,8

3,4

1,4

D L-ìàëàò

1,9

1,4

1,5

Лейцин

2,9

3,0

Глутарат

Гексан

1,4

2,0

1,5

Декан

Та блица 2

Исходный материал

Общий бе лок, мг

Общая ак тивность ммоль/

/мин

Специфическая

Выход, Х активность, ммоль/

/мин/мг

Грубый экстракт или осадок (70X насыщения) 5800

6060

1,04

Супернатант (40X насыщения) 1050

1650

1,5

27 2, (40X насыщения) 550

4040

7,3

Составитель И.Привалова

Редактор А.Мотыпь Техред А.Кравчук; Корректор Н.Король

Заказ 4127/27 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4