Способ получения ноурзеотрицина

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретения - повышение производительности способа . Сущность способа сводится к тому, что культуру-продуцент на первой стадии ферментации выращивают в условиях лимитации по фосфору. Для этого концентрацию фосфата в питательной среде устанавливают ниже 10 мг/л. В процессе ферментации регулируют величину рН, поддерживая ее на уровне 5,0-6,5. Концентрацию углерода и азота в процессе ферментации поддержи вают в пределах 5-15 г глюкозы/л среды и 0,015-0,2 г аминного азота/л среды, а парциальное давление устанавливают на уровне 30-60% от полного насыщения среды. Через 130 ч ферментации достигается биологическая активность порядка 8000 - 11000 мкг антибиотика/мл культуральной жидкости. I (/ С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

L А: " Г:"5 .ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (89) DD/230562 (48) 04.12.85 (21) 7773570/28-13 (22) 01.10.84 (31) WPC 12Р/255943 (32) 25.10.83 (33) DD (46) 15.09.88. Бюл. № 34 (71) Народное предприятие «Йенафарм>. (DD) (72) Хеллер-Ингенборг, Плонка Гунтер, Шнайдер Йорг, Майер - Арнфрид, Редер

Бернд, Зекель Норберт, Тщекель Уте, Вернер Виля, Мюллер Петер-Юрген, Гроссе

Ганс-Гельмут, Бергтер Фридрих, Бокер Гаральд и Меннер Михаэль (DD) (53) 615.778.9 (088.8) ÄÄSUÄÄ 1423588 А 1 511 4 С 12 P 1/06 // (С 12 P 1/06, С 12 R 1:57) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОУРЗЕОТРИЦИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретения — повышение производительности способа. Сущность способа сводится к тому, что культуру-продуцеит на первой стадии ферментации выращивают в условиях лимитации по фосфору. Для этого концентрацию фосфата в питательной среде устанавливают ниже 10 мг/л. В процессе ферментации регулируют величину рН, поддерживая ее на уровне 5,0 — 6,5. Концентрацию углерода и азота в процессе ферментации поддержи вают в пределах 5 — 15 г глюкозы/л среды и 0,015 — 0,2 r аминного азота/л среды, а парциальное давление устанавливают на уровне

30 — 60% от полного насыщения среды. Через 130 ч ферментации достигается биологическая активность порядка 8000

11000 мкг антибиотика/мл культуральной жидкости.

1423588

Изобретение относится к новому способу ферментативного получения ноурзеотрицина.

Ноурзеотрицин является антибиотиком стрептотрициновой группы, который после его назначения в эрготропных дозах вместе

Г с кормовыми рационами сельскохозяйствен но-полезным животным обуславливает ускоренный прирост живой массы, а также Одновременно умсньше затрат кор»a. Ноурзеотрицин используют для животноводческого производства, а также для фармацевтической и комбикормовой промышленности.

Антибиотик ноурзеотрицин, изолированный из культуры варианта штамма Streptomyces noursei АТСС 11455, активен in vitro в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также в отношении микобактерий.

Образующий антибиотик ноурзеотриции штамм стрептомицетов под названием Streptomyces. noursei ZIMET JA 3890Ь депонироВаН в illvae(. .. i .. . «:. !I I pa, i> . ° il((I ИТ 1 та микробиологии и экспериментальной терапии Академии наук ГДР.

По известным из литературы способам культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях. Д.!«я этого лиофилизи рованный на земле споровый материал этого, штамма стрептомицетов переносят на соот ветствующие агаризованные питательные среды. После 6 в 10-дневного инкубирования при 28 — 30 С проросший спорулирующий мицелиальный газон используют для засева жидких стерильных питательных сред, засев можно осуществлять также непосредственно при помощи консервированного лиофилиза цией на желатине глубинного мицелия ноурзеотрицинообразующего штамма стрептомицетов.

Жидкие питательные среды для глубинного выращивания посевного материала содержат в качестве субстратов источники углерода и азота, а также неорганические соли. В качестве источника углерода :«спользуют глюкозу и/или глицерин. В качестве источника азота применяют, в частности, соевую муку, различные аминокислоты и/или аммонийные соли. Наиболее благоприятная для выращивания посевного мате1 риала кислотность имеется в начале культивирования в пределах рН 6,0 — 6,7. Инкубирование проводят при 28 — 30 С в течение

24 — 48 ч. Получаемый таким образом посевной материал служит для засева >кидк!«х стерильных питательных сред для питания основной культуры. Такие питательные среды состоят из источников углерода и азота, а также из неорганических солей. В качестве источника углерода. используют кукурузный экстракт и/или глюкозу. В качестве источника азота применяют, в частности, соевую муку, различные аминокислоты и/или ам монийные соли. Наиболее благоприятная для образования антибиотика кислотность составляет в начале ферментации рН 6,0--10

7,5. Культивирование осуществляют прН

26- — 32 С, предпочтите.«(ь! о 28 — 30 С, в течение 150 ч.

Глубинное культив((рс:;а «е штамма

51гер1оп«усев nourse! ZlivtET JA 3890 b осу«цествляют известным oopа""." Ila l(a .алке или в ферментаторах с пере.,;ешиванием и аэрацией без прибавления субстратов или регулирования значения рН.

При этом известно, что сравнительно незначительное ноурзеотрицинообразованис на первоначальной ферментяционной среде может увеличиваться в 5 — -10 ряз в известHbI.< TeI(HHHecHH ycëoã.IHI,, если в начале выращивания основной культуры прибавляют аминоарилка-,боновые кислоты, в частности 5 — 10 ммоль/л о-аминобензоиной кислоты (Вгс1«ег Н. und Thrum H.: Stimula!ion

oi i!ourseothricin p-.0ducti0n by aminobeIizoic acids. 1п: Hегоld М und (. ЯЬг«е1 Z.: Antibio!ics-Advances,r. гезеа(ch, production

a!! d (1«niсa I !«sе. !.Оп (10п, 963, р. 5(«4. b«s 587;„

Однако фермгнтатив(юе производство ноурзеотрицина с использованием аминоарилкарбоновых кислот, котого=, ка1 известно, хотя и позволяет значительно увеличивать выход ферментации, н0, в частности, в отношении затрат, стерилизации и проблем. связанных со сточными водами, имеет недо статки, которые мешают внедренHio способа в промышленное производ(тво.

Известно также, что на биосинтез большинства вторичных метабо..итов отрицательно влияет избыточный фосфат «М;! ãtin J. F., und Der(lain А. 1.: СОП1го1 of antibiotic biosynthesis.— li4icrobioh Rev. 44, 230

bis 25 l (1980) . Поэтому ««икробиолог!«.-«еские процессы ферментяцни для получе(-:Ия вторичных мгтаболитов, например à "Tl«áHOтиков, проводят при концентряци! х фссфятя суооптимальных для роста Образователя.

Для ферментяции в технических масштабах в целях получен 15I вторич:ых метаболитов используют, как правило, комплексные компоненты питательной среды растительного и животног0 происхождения, такие, как крахмал, соевая мука, кукурузный экстракт, мел.(Оса, мясной эк,rrpaH! и "p. ТaêHe

КОМ!«ЛЕКСПЬ(Е КОи«ПОПЕIIFI=. i(!««ai г Içuou РЕД«( имеют по «(ере I .роисхо)кдения н iредвapHтельной обработки различное содержание оощего фосфатя с различной биологическо доступностью. Часть дос":, иного фос(рата имеется в ферментационной среде D фор:«е раствори. OI 0 фосфата. Это обстоятельство принцHHHa;!I.IIÎ зят рудняе-., стa!Iдяртизяцию питательных сред.

Однако начальные кс:-. el.rp-:цин ряствоPHi1ОГ0 ИЛИ ДОСТ; IIHOI O i++:)ÑôaÒa ИI1elÎТ шяющее значение для фер «ентат:.з!«Ого выхода ож««даемого вторичкого;:етаболита, поскольку Опоедел(.нное количес1 в(фОсФяia необходимо для рос«а микроорг .;«i;"-:, я— продуцента, а слип(ком высокие начальные

l -423588 концентрации фосфата подавляют образование вторичного метаболита.

При улучшении микробиальных способов получения вторичных метаболитов питательную среду и микроорганизм — продуцент приспосабливают друг к другу путем взаимного модифицирования так, чтобы между обоими противодействующими регулирующими факторами воздействия фосфата устаНОВИЛСЯ КОМПРОМИСС.

Однако путь постепенного повышения продуктивности связан с затратами времени и расходами.

Кроме того, известно, что наряду с регулирующим воздействием на процесс путем изменения состава питательной среды выход ферментации можно улучшать также путем управления ферментационным процессом, предпочтительно управления в реальном масштабе времени (SIIkatsch D. А. ц. Nesemann

С1.: AIItomatische Рагагг1е(егег assIIng hei inдивtriellen Fermentationen.— Chemic-Technik 20

6, 261 (1977) .

В случае использования режима управления в реальном масштабе времени, необходимого для эф1рективного зедения процесса ферментации, трудность заключается в том, что вместо концентраций субстратов, чаще всего определяемых только дополнительно трудоемким химическим анализом, приходится прибегать к измерению принятых в ферментационной технике непрерывно определяемых обших параметров процес- 30 са — рН, р02, количества дозируемых добавок, состав отходящих газов, теплообразовапие — как первичных регулируемых параметров процесса.

Цель изобретения — — повь:шение производительности способа.

Сущность изобретения сводит" я к следу1011! eмv.

В основу изоорете11ия положена задача представить тех»ически удобный способ, который путем вед1 ния npoliåñña с лимитированием ио предельным значениям и увеличения времени продуктообразования позволял оы осуществить про лышленное производство ноурзеотрицин-1 с высоким обьемновременнь1м выходом ф рмептации.

Pen,. .ипуе.ла,"-. ";.; 3aäa!III I.. с. 13 1ях зна.чений pi. в пределах 7,2 — -Я,л термостеоилизация культуральной среды, раздельная стерилизация компоllентов (глюкоза и сульфат аммония); лимитированное по скорости дозированное -.ðèáàâëåíèe субстрата (прибавлен1 е извне ил1 высвобождение субстра- g0 тов из компонентов питательных веществ), регулирование заданного значения рН в пределах 5,0 — 6,5 во время ферментации особенно эффективно влияют на метаболичес:-:и активности ноурзеотрицинообразуюн;их культур (дь, хание, глюкознь1й об. ;:ен, азотный обмен, антибиот1кообразование).

При этом особое -: ачение имеет, что на протяжении всего периода ферментацки отношение концентраций углерода к азоту составляет не менее 5 — 15 г глюкозы/л к

0,015 — 0,2 г аммонийного азота/л среды.

За счет заданного режима стерилизации с начала ферментации обеспечивается лимитированное по скорости высвобождение фосфатного буфера в пределах О,l — 10 мг/л предпочтительно из комплексных азотных компонентов питательной среды. Этот предел концентрации особенно выгодно влияет на необходимый для биосинтеза антибиотика ход обмена веществ (C:N) в указанном соотношении концентраций.

В тесной связи с эффективной метаболической активностью в процессе ферментации следует рассматривать регулирование рН в пределах 5.0 — 6,5. Необходимый и выгодный для биосинтеза антибиотика ход обмена веществ особенно активируется в этих пределах.

Для сохранения требуемого соотношения концентраций глюкозы/азота необходимо дозировать сульфат аммония до достижения физиологически оптимального диапазона рН.

Неожиданно было найдено, что соответствующий интервал заданных значений регулирования рН кул туральной жидкости устанавливается в пределах эффективных с точки зрения физиологического регулирования рН 5,0 — 6,5 при прибавлении раствора гидроокиси аммония соответствуюгцей концентрации, а вместе с тем гарантируется концентрация азота д.1я соотношения концентрации глюкозы/азота.

Способ ведения процесса обеспечивает лимитированное по скорости высвобождение фосфатного буфера.

Та1<ой способ регулирования процесса позволяет через 20- — 140 ч ферментации при парц1альном давлении кислорода рО в пределах 30 — -80%, предпочтительно 40%, обеспечить биоло".è÷åñêóþ активность, даю:цую 8- — 11 кг ноурзеотрицина на тонну культуральной жидкости.

Пример. Суспензия лиофилизированного консервного мицелия в физиологическом растворе поваренной соли, полученного от штамма — продуцента ЯгeptGITlусев поцгзе1, служиэ в качестве инокулюма для первого глубинного пассажа.

Питательная среда содержит, г/л: глюкоза 15; соевая мука 15; карбонат кальция

1,О; i.lîðllä натрия 5,0; дигидрофосфат калия

0,3; водопроводная вода до 1000 мл, рН 6,5—

6,9 (разливать г1о 50 мл в 500-мл колбы на качалке).

Стерилизацию среды производят при

120 C в течение 35 мин.

После 48-часQBQ:о культивирования при

28 С н» ротационной качалке культивируют

2-й глубинный пассаж (разлив 250 мл, 2000 — — мл колоы на кача,чке) В соотн01пенни

1 ч инокулюма к 25 ч питательной среды в течение 24 ч на ротационной качалке.

600 мл 2-го глубинного пассажа используют

1423588

Составитель

Редактор Н. Киштулинец Техред И. Верес Корректор О. Кравцова

Заказ 4607/30 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 для засева 800 л среды посевного ферментатора.

Питательная среда содержит, г/л: глюко. за 15; соевая мука 15; дигидрофосфат калия

0,3; хлорид натрия 5,0; карбонат кальция

1,0; антафрон 5,0; подсолнечное масло 37,5.

Значение рН устанавливают перед стерилизацией на 7,6, после стерилизации оно составляет 6,8 — 7,0. Стерилизацию осуществляют при 120 С в течение 60 мин.

После 30-часового культивирования при

28 С потребляется около 60 мг растворимого фосфата на литр, причем образуется 12—

15 г биомассы на литр.

Количество инокулюма в 800 л достаточно для засева около 18 мз производственной среды основной культуры.

Питательная среда производственного фермснтатора содержит, г/л: картофельный крахмал 32,0; соевая мука 15,0; хлорид натрия 1,0; карбонат кальция 6,0; сульфат цинка 0 5; сульфат магния 2,0; подсолнечное масло 3,0; антафрон 0,3; глюкоза 10 — 35; сульфат аммония 2 — 1.

Компоненты глюкозы и сульфата аммония прибавляют к питательной среде после раздельной стерилизации (120 С, 30 мин).

Стерилизацию среды производят при

115 С в течение 60 мин, причем до начала устанавливают значение рН 7,8, которое по окончании стерилизации достигает значений в пределах 7,2 — 8,2.

Пополненная среда достигает значения рН в пределах 7,0 — 7,4. Ферментацию производят при 28 С с соотношением аэрации

0,3:1 (мз воздуха:мз культуральной жидкости в 60Уо)

Если предельные значения не достигают величины 5 г/л для глюкозы и 0,2 г/л для аммонийного азота, эти компоненты прибавляют как 50Я-ные стерильные растворы, пока культуральная жидкость не достигает рН 5,2 при значении аммонийного азота свыше 300 мг/л.

В дальнейшем прибавление аммонийного азота осуществляют дозированным прибавлением аммиачной воды при постоянном рН

5,5. Через 130 ч ферментации достигается биологическая активность порядка 800—

11000 мкг ноурзеотрицина на мл культу15

Формула изобретения

Способ получения ноурзеотрицина путем культивирования штамма Streptomyces r1oursei ZINET JA 38906 в питательной среде, 20 содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные и органические добавки, в условиях аэрации и перемешивания, отличаюи4ийся тем, что, с целью повышения производительности способа, в начале ферментации устанавливают концентрацию растворимого фосфата в питательной среде ниже

10 мг/л, в процессе ферментации поддерживают величину рН в пределах 50 — 65, отношение концентраций углерода и азота поддерживают в пределах 5 — 15 r глюкозы/л среды и 0,015 — 0,2 r аминного азота/л среды, а парциальное давление кислорода устанавливают на уровне 30 — 609n от полного насыщения среды.