Способ получения перманентно растущих животных и человеческих клеток

 

Изобретение касается способов приготовления перманентно выращиваемых животных и человеческих.клеток и применения полученных клеток для производства клеточных продуктов. Цель изобретения - упрощение способа, Для этого осуществляют слияние нормальных животных или человеческих клеток в присутствии объединяющих веществ (полиэтиленгликоля или вируса Sendai). Получают фрагмент трансформированных клеток. Прорывают стенку клетки (разрушают) путем лизиса в глицерине с внесением в несодержащий глицерин буферный раствор (при этом лопаются клеточные мембраны) или механически. Центрифугированием отделяют фракции ядер от фракций цитоплазмы и используют все фракции. Фракции цитоплазмы обогащают митохондриями лимфатических или этитолиальных опухолевых клеток. Приготавливают кариопласты и цитопласты, обрабатывая клетки цитохалазином. Полученные окруженные клеточными мембранами клеточные ядра (кариопласты) и окруженная мембраной, лишенная ядра цитоплазма (ц 1топласты) пригодны для слияния. Фрагменты клеток в свежем состоянии используют непосредственно после их приготовления или позднее, обеспечивая их сохранение в лиофилизированном состоянии. 2 з.п. ф-лы, 5. табл. О)

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК (1Ю (111

А3 (504G 01 N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3594155/28-14 (22) 03.05.83 (31) P 3216650.8; P 3245665.4 (32) 04.05.82; 09.12.82 (33) DP (46) 15.09.88. Бюл. Ф 34 (71) Берингер Ианнхайм ГмбХ (DE) (72) Херберт Юнгфер, Хайнрих

Бархет (DE) и Винфрид Альберт (AT) (53) 616.07(088.8) (56) Coutinuons culture of fused се11в secreting antibody of pnedefined specifity, Nature, 25ф, 495-497, 1975. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРИАНЕПТНО, РАСТУЦИХ К(ИВОТНИХ И ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ

КЛЕТ01: (57) Изобретение касается способов приготовления перманентно выращиваемых животных и человеческих, клеток и применения полученных клеток для производства клеточных продуктов.

Цель изобретения — упрощение способа.

Для этого осуществляют слияние нормальных животных или человеческих клеток в присутствии объединяющих веществ (полиэтиленгликоля или вируса Sendai) ° Получают фрагмент трансформированных клеток. Прорывают стенку клетки (разрушают) путем лиэиса в глицерине с внесением н несодержащий глицерин буферный раствор (при этом лопаются клеточные мембраны) или механически. Центрифугированием отделяют фракции ядер от фракций цитоплазмы и используют все фракции.

Фракции цитоплаэмы обогащают митохондриями лимфатических или этителиальных опухолевых клеток. Приготавливают кариопласты и цитопласты, обрабатывая клетки цитохалазином. Полученные окруженные клеточными мембранами клеточные ядра (кариопласты) и окруженная мембраной, лишенная ядра цитоплазма (цитопласты) пригодны для слияния. Фрагменты клеток в свежем состоянии используют непосредственно после их приготовления или позднее, обеспечивая их сохранение в лиофилизированном состоянии. 2 з.п. ф-лы, 5, табл.

1424744

Изобретение относится к способу приготовления перманентно выращиваемых животных и человеческих клеток и к применению полученных линий клеток для получения клеточных продуктов.

Цель изобретения — упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Слияние осуществляют известными методами в присутствии объединяющих веществ — предпочтительно в присутствии полиэтиленгликоля или вируса (Sendai). Получают фрагменты трансформированных клеток.

Прорывают стенку клетки путем лизиса или механически. Затем путем центрифугирования отделяют фракции ядер от фракций цитоплазмы и исполь- 20 зуют все фракции, Осуществляют лиэис путем набухания клеток в глицерине и последующего внесения в несодержащий глицерин буферный раствор. Это приводит к тому, что лопаются клеточ- 25 ные мембраны, Приготавливают кариопласты и цитопласты путем обработки клеток цитохалазином. Полученные окруженные клеточными мембранами клеточные ядра (кариопласты) и окружен- Э0 ная мембраной, лишенная ядра цитоплаз- ма (цитопласты) пригодны для слияния.

Фрагменты клеток в свежем состояl нии используют непосредственно после их приготовления или позднее для осуществления слияния, причем в последнем случае обеспечивают сохранение в лиофилизированном состоянии.

Применяют фракции клеток, которые могут быть неполностью чистыми, одна- 40 ко не должны содержать никаких интактных, способных размножаться клеток.

Для образования гибрида не исполь" эуют в качестве вырожденной клетки

НАТ-чувствительную клетку, Перманентно растущие линии клеток, которые не обладают НАТ-чувствительностью э используют для приготовления фрагментов для слияния.

При описании конкретных примеров используются следующие сокращения и товарные названия:

AK антитело;

Ig иммуноглобулин;

Н- или

L-цепь — "тяжелая" или "легкая" протеиновая цепь Igмолекул;

2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекан; пристан

НАТ-се» лекционная среда—

ТК

HGPRT

EBV

MuLV

ДИСО

ДИЕГ1

FKS

Fico11

ПЭГ

PBS

P0D

ABTS

EBSS

RPMI 1640—

Трис

РВ?.

MNC

hTSH

Р-hTSH

CFA

IFA

Г1етоцель1500 ме тилцеллюлоза (FL и KA); питательная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидкн; тимидин-киназа; гипоксантин-гуанинфосфорибоэилтрансфе раза;

Эпштейн-Барр-вирус; лейкемийный мышиный вирус Abelson; цитоплазмин В, антибиотик (ALDRICH

BI0CHEMICALS, Milwankee, CLlA); диметилсульфоксид; эссенциальная минимальная среда Dulbecco; эмбриональная телячья сыворотка; полимерный тростниковый сахар (сахароза), РНАРЛАСIА3 полиэтиленгликоль; буферированный фосфатом рассол; пероксидаза; аммониевая соль 2,2-азино-ди-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты); равновесный солевой раствор EarIe;

Posewell Park Memory

Institut (среда); трис(оксиметил)-аминометан; периферические лимфоциты крови; мононуклеиновые клетки (лимфоциты, моноциты); человеческий, стимулирующий Thyreoidea гормон; -цепь; вспомогательное средство Freund; полное вспомогательное средство Freund; неполное вспомогательное средство Freund;

14 24 74

Ct1V

FITC-Covaspheres

55 пуэblpeк iieмбрлн!iой цитопллэмы (цитопллзма — мембрана — пузырек); флуоресциниэотиоцилнат в шаровидной форме (C0VAIENT TECHNICAL

Апп Arbor, Иич. C12A);

EAZ асцитные клетки Эрлиха (АТСС; CCL, 77) .

Пример 1.

А. Получение кариопластов и цитопластов из мьшгиных миеломных клеток линии Р3 Х 63 Ag 8.653 АТС No-CR

L 1580.

А. 1. Цитохалаэин В (СВ, Al drick

Biochemicals, t1i1waakee, СНА) растворяют в диметилсульфоксиде (ДИСО,, Иеген; 2 мг/мл) и хранят в качестве о основного раствора при 4 С.

Ficoll-400 (Pharmacia; полимеризованная сахароза) растворяют в бидистиллированной воде (1 г/мл), автоклавируют ы хранят в виде 50%-ного основного раствора при -20 С.

Однократной и двойной концентрации эссенциальную минимальную среду

Dulbecco (Д?1ЕИ), эмбриональную телячью сыворотку (FKS), Ь-глютамин (200 ммоль/л), стрептомицин-пенициллин Boehringer ?1annheim целлюлоэо итратных трубочек стерилизуют путем

УФ-облучения.

Линия миеломной клетки Ag 8.653

АТСС СР Ь вЂ” 1580 : 123, 1548-1550 (1979). Она азагвинин-резистентна, flAT- ÷óâñòâèòåëüíà и не синтезирует ни Н-, ни L- Ig-цепей. Она хранится в ДИЕ?1 + 157 FKS + глютамин + пенициллин-стрептомицин + пируват (-gMEMо полная среда) при 37 С в атмосфере с 7% СО, А,2. Иетоды энуклеации: 8х.10 Ag

8.653 клеток центрифугируют в течение

5 мин при 10 об/мин и повторно суспендируют в 12 мл 1,57-ного FicollДИЕИ-СВ-ДИСО-раствора до тех пор, пока не будет получена лишенная комков клеток суспензия. По 3 мл суспензии клеток наносят на предварительно (за 4 и 12 ч) препарированные

Ficol) градиенты и покрывают 2 мл не содержащего Ficoll ДИЕТ-СВ-ДИСО-раствора. Пробирки с градиентами центрифугируют в ультрлцентрифуге в течение

60 мин при 25 000 об/мин (31 С).

П о о к о н ч л н и и ц с i i т р и ф у! n p t » н л н и я C i < I », » х у рлзделг по сoC прлют помлnoi иньс кционн. го шприца длинной клннлей млкроскопически видимые фрлкции (пс— лосы ), каждую рлэблвляют питательной средой (ДИЕ11 беэ добавок), седиментируют путем центрифугировлнил и снова суспендируют в свежем П?1Е?1.

Получают следующие 4 фракции: а) клетки Debnis (нл границе между

0 и 12,5% Fico11); б) лишенные ядра цитопллсты в области 15-167. Ficol1; в) ядра без различимого ободка иэ плазмы и примерно 27. лишенных ядра

"клеток" на границе между 17 и 25%

Е со?1; г) содергклщие ядра, интактные по морфологическим критериям клетки с хорошо различимым ободком из плазмы и немного ндер беэ ободка из плазмы в качестве седиментл на дне пробирок.

Подсчет клеток показывает, что

Ях10 Ag 8.653 — клеток в б содерт жит 1, 5õ10 цитопллстов, в в —

6 7

4х10 кариопластов и в г) — 1, 1х10 предположительно интлктньг; Клеток.

Б, Слияние клеток селезенки мыши с изолированными кариопластами миеломы, цитопластами миеломы и седиментными клетками миеломы иэ опыта А.

Б.1. Способствующее спляшите средство . 20 г полиэтиленгликоля (ПЭГ4000) расплавляют в автокллве, охлажо дают до 56 С и при этой температуре смешивают с 20 мл ДМЕ?1;

HAT — селекционная среда: ко всей среде JI?iE?1 добавляют аминоптерин

-г л (4х10 ?1), тимидин (1х10 ?1) и гипоксантин (3, 1х10 t1) .

Сосуды для культивирования: кластер 24-тканевой культуры и кластер

96-тканевой культуры фирмы Costar

Камбридж, Иасс., СНА.

Б.2. Слияния. Препарированные в опыте А фракции б, в и r раздельно смешивают с клетками селезенки в соотношении 10:1 и седиментируют путем центрифугирования. Надосадочную жидкость тщательно удаляют. К седименту добавляют 0,8 мп 507-ного раствора

ПЭГ (при 37 С в течение 1 мин при постоянном мягком встряхивании) и затем 5 мл Д?1Е?1 (при комнатной температуре в течение 5 мин). Псгле добавки следующих 20 мл "gfg?1 клетки седиментируют, повторно суспендируют в свежей Д?1Е?1полной (noinioni. иной) среде (5 мл) и размещают нл кльлые 10, 30

А 664

В 526

D 794

11 21

5 14 покрытые "питающими клетками" 24-ые

Costar Tupfel/Costar = пятна", "поры" . Отдельные культуры кормят на каждый 1, 2, 3, 7, 10 и 13-й день с помощью ДИЕИ-полной среды.

Клетки питающего организма (макрофаги брюшной полости). За день до слияния умерщвляют инцухтныя мышей (BaIb/ñ) путем вытяжки. В стерильных условиях в брюшную полость шприцом вводят 4-5 мп PBS и спустя 1 мин снова отсасывают. Вымытые клетки промывают ДИЕИ, суспендируют в полной среде до плотности клеток 2х10 в

1 мп и порциями по 0,5 мл размещают на 24-ых Costar Tupfel/Costar- пят- нах

Клетки селезенки. У одной Balb/смьппи непосредственно перед слиянием в асептических условиях удаляют полностью селезенку и ее клетки суспендируют в ДИЕИ. Клеточные агрегаты и кусочки ткани отфильтровывают через марлю, EL ISA на иммуноглобулине мьппи.

Пластинки для микротитра покрывают овечьими антителами на мышиный Ig(lgG-

I фракция; 10 мкг/мл, 0,97.-ного раствора ЛаС1; 150 мкл раствора антител на Tupfel (пора, пятно). По 100 мкл культуральной надосадочной жидкости пипеткой вносят в покрытые пятна . (Tupfå1) и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. После отсасывания надосадочной жидкости и 2-кратной промывки Tupfel ("пор", "пятен") покрывают 100 мкл раствора конъюгата

РОД с антимышиным Ig (такое же антитело, как вышеуказанное, ковалентно связанное с пероксидазой хрена) и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. После 3-х кратной промывки на Tupfel пипеткой наносят 100 мкл раствора субстрата (ABTS) и фотометрически определяют появление окраски.

Б.З. Препарированные согласно опыту А цитопластные, кариопластные и седиментные фракции параллельно подвергают слиянию с клетками селезенки

Balb/с-мыши и размещают на каждые 10 по мл культуры. По 5 частичных культур кормят без (пластина I) и по

5 с добавкий НАТ (пластина II).

Вплоть до 21-го дня после слияния ни в одной иэ пятнообразных пластин не обнаруживают макроскопически или микроскопически рост лимфоидных кле24744 6 ток, эа исключением пятен 4А, 4В, 40, 3С и ЗД на пластине I которые содержали продукт слияния (-Fusionat)

5 седиментной фракции без flAT-среды.

В этих пятнах уже спустя 5 дн после слияния распознают колонии, которые быстро увеличиваются. Ela 8-й день после слияния в эти пятна (Tupfel) добавляют НАТ-среду: в течение 4 дн вследствие этого погибают все видимые колонии. На 27-й день после слияния прежде всего разъединяются, затем примерно на всех пятнах становятся видимыми колонии, которые состоят из крупных шарообразных, прозрачных, растущих не сросшихся клеток.

На 65-й день после слияния, эа исключением I-3B, II-1A, II-4A, все

"пятна заняты множественными колониями лимфоидных клеток. Исследование надосадочной культуральной жидкости на содержание мышиного Ig на этот день дает (см. табл. 1) от

25 положительных до сильно положительных значений в ЕЬ ISA во всех частичных культурах, за исключением вышеуказанных, не содержащих колоний "пятен".

Таблица 1

EL ISA для доказательства мышиного иммуноглобулина в надосадочной жидкости культуры опыта Б (65-й день после слияния): (Tupfel) "Пятнообразная

35 пластина для культивирования

I : без НАТ (исключения: 4А, 4В, 4С, 3С, ЗД: + НАТ>8-18 дни;

1 — продукт слияния цитопластов; 2 — продукт слияния карио40 пластов; 3 — продукт слияния седиментных клеток

2 3 4 5 6

"Пятнообразная" пластина для культивирования II: с НАТ (1-14 дни отрицательная культура 1 (ДИЕИ-полная

7 14 среда): 010; отрицательная купьтура 2 (ДЖЕИ, бе з FKS): 040; положительн ая культура 1 (мьппиная сыворотка 1х10- ):

723; положительная культура 2 (мышиная сыворотка ix10 ): )1500

2 3 4 5 6

А 008

В 267

С 656

D 848

1 2 3

Как видно иэ табл. 1, слияние кариопластов с клетками мьппиной селезенки приводит к in vitro размножающимся, выделяющим иммуноглобулин клеткам. Хотя только малая часть цитоплаэмы злокачественного партнера вводится в гибрид, он не приводит к возможной экстинкции признака нперманеитного ростан. При этом полученные с кариопластами гибридные клетки синтезируются и выделяют мышиный иммуноглобулин в "гибридомных" количествах. Отсутствие доли цитоплазмы

Ag 8.653 не нарушает соответственно этой продукционной и секреционной способности гибридов кариопласта с клеткой селезенки. Кроме того, из слияния цитопластов с клетками селезенки также следуют клоны клеток, I которые in vitro пролиферируют и выделяют антитела.

Пример 2, фрагментация клеток посредством лизиса глицерином и слияние с человеческими лимфоцитами крови.

Балансирующий солевой раствор

Earle (EBSS), питательная среда

RPMI 1640, эмбриональная телячья сыворотка (FKS) Boehringer Man"

nheim 8-азагуанин (8-Ag) Serva (Гейдельберг), Агар (бакто-агар 16 14)

Difco — фирма Гедингер КГ, Итутгарт), Человеческая плаэмоцитомная линия

HS SULTAN ATCC CP. L-1484 в виде криопредохраненного клеточного материала оттаивается по предписанию АТСС и культивируется °

24744 8

5

8х10 HS Su 1 tan — кле гок в 100 мл

К РИ1 1640 — полной среды, которая содержит 201п M Я-Ag, культивируют

48 ч. Пережившие клетки помещают в

10 мл Pt1I 1640-полной среды без

8-Ag и выращивают 10 дн. Клетки затем высевают на пластины из мягкого arapa, которые были приготовлены с помощью R PMI 1640-полной среды +

2G ) t1 8-Ав. (примерно 500 клеток на чашку Петри), и помещают в

СО -инкубатор. Спустя 9 дн стерильно

z отделяют изолированно выросшие колонии от поверхности агара и размножают в -R PMI 1640-полной среде + 8-Ag.

Клон (обозначается в виде НБSULTAtJ-8 Ag-RI), который вырос при удвоенном времени (примерно 20 ч) применяется для следующего опыта.

HS-RI клетки НАТ-чувствительны: клетки, которые культивировались в

НАТ-среде с плотностью (1-5)х10 на

1 мл (R PMI-1640-полная среда с

0,1 ммоль гипоксантина, 400 р 11 аминоптерина, 3 1 ц t1 тимидина), не размножаются и в течение 7 дн полностью погибают °

Человеческие лимфоциты (из периферической крови: PBL): 300 мл венозной крови стерильно собирают в гепариновый раствор (2 ед/мл крови) и стандартными методами выделяют фракцию моноядерных клеток (t1I

Фрагментация НБ-РI: клетки нагружаются глицерином и подвергаются лизису путем инкубации в 10 (4t1 трис-НС1-буфере. Ядра отделяют от мембранных пузырьков путем центрифугирования при ускорении 200 е (10 мин, 4 С), эти пузырьки, со своей стороны, седиментируются путем центрифугирования при 5000 g (40 мин, 4 С).

Слияние, Примерно 1х10 729 HS — R I ядер с человеческими лимфоцитами суспендируют в R PMI 1640 в соотношении 1:1 и подвергают слиянию посредством ПЭГ, как в примере 1, и. Б 2, Седимент мембранных пузырьков примерно из 1х10 HS R 1 клеток поке

7 рывают суспензией 1х10 человеческих

44 lp клеток, которые непрерывно увеличиваются по размеру.

Продуцирование человеческого иммуноглобулина. На 21-й день после слияния надосадочную жидкость культуры (на 19-й день произведена полная замена среды) исследовали на содержание человеческого иммуноглобулина.

Результаты представлены в табл, 2а и б.

Т а б л и ц а 2а.

1 2 3 4 5 6

D 120 1148 024 096 023 151

1 2 3 4 5 6

D 171 173 141 116 218 699

1 2 3 4 5 6

В 116 500 469 315 315 627

C 120 050 068 159 226 145

1 2 3 4 5 6

9 14247 лимфоцитов и подвергают слиянию посредством ПЭГ, В контрольной смеси примерно

2х10 HS-RI ядер поглощаются (растворяются) в К РИ1 1640-полной среде (без НАТ) и культивируются в 4-х, 24-х Costar-Tupfeln (Costar- пятен") в Ср -инкубаторе.

Все слившиеся клетки (Fusionate) и контрольные культуры культивируются на макрофагах брюшной полости мыши, как в примере 1, в качестве клеток питающего организма. EL ISA для доказательства челоДоказательство человеческого Ig 15 веческого иммуноглобулина в надв надосадочной жидкости культуры: осадочной жидкости культуры микротитр-Elisa как в примере 1, (слияние кариопластов, 21-й день п. Б.2. Для покрытия применяют имму- после слияния) ноадсорбционно очищенное овечье анти- I + НАТ тело на человеческий Ig, Такая же

АК-препарация используется для приготовления конъюгата POD с человеческим анти Ig Овечья АК реагирует со всеми А 029 147 286 147 228 270 классами человеческих Ig и не проявляет никакои перекрестной реакцион 2 В 171 086 050 144 846 12 1 носпособности с бычьим или мьппи- С 118 156 250 082 179 059 ным Ig.

Фрагментация благодаря лизису с помощью глицерин-трис-НС1. ОбработI НАТ ка разлагает HS-RI-клетки на содержа30 щую ядра фракцию, которая седиментируется при 200 g, и на лишенную ядер цитоплазмамембран"ую пузырьковую А 660 233 175 270 410 322 фракцию, которая седиментируется при

5000 g Под микроскопом не видны ни в одной из обеих фракций интактные

НЯ-RI-клетки, Ядра окружены более или менее нерегулярно ограниченными обрывками цитоплазмы. Подсчет дает выход ядер 85Х. Пузырьковая фракция

40 содержит наряду с небольшим количестII t ПЛТ вом осколков (остатков) в большом количестве пузырьки величиной 0,5-2 р?1 беэ распознаваемых составных частей ядер.

7 45

А 135 290 107 279 530 674

Культивирование 2х10 ядер в

R PMI-полной среде (без ИАТ) не приводит на протяжении 12 нед ни к какому росту HS-RI-клеток.

D 191 Р78 686 11Р 242 56 1

Слившиеся клетки (Fusionate) ядрапимфоциты и цитоплазма — пузырьки- I I — НАТ пимфоциты размешиваются на 96, соответственно 1024-x Costar Tupfeln (Costar- пятен") и культивируются каждый наполовину с или беэ добавки

НАТ и R PMI-полной среде на макрофагах мышей. С 2-й недели после слияния появляются колонии лимфоидных

l 2

ll l 424744

Таблица 2б

Слияние цитопластов,2l é день после э слияния, где 1 — ядерная контрольная P культура; 2 — с HAT 3 - без HAT. э

Если ус танавливают в еличины кстинкции 0-99 как от от— ицательных до сомнительных

5 качения 100 — 200 — как поло жительные, значения более 200— как сильно положительные, то для пол ченных путем слияния ядер культур получается рас

10 пределение, которое представлено в табл. 3.

Таблица 3

EL ISA на человеческом иммуноглобулине

Отрицательно Положительно Сильно положительно

18

С НАТ (п=49) (Х) (40) (37) (23) 34

Беэ НАТ (п=48) (Х) (71) (25) (4) Таким образом, слившиеся клетки (Fusionate), которые приготовлены с помощью лизисных фракций, могут культивироваться без НАТ-селекции.

Способ намного менее требует затрат на работу, чем экструзия цитохалаэином В, и дает способный к слиянию материал с высоким выходом. Четкое разделение "ядерных" и "цитоплаэмамембранных" фракций не достигается ни одним из обоих способов. Как содержащая преобладающе ядерный материал, так и также содержащая преобла. дающе цитоплаэма-мембранные пузырьки фракция после слияния с человеческими лиифоцитами иэ крови дает in vitro способные размножаться, АК— продуцирующие клеточные клоны.

Параллельная смесь ядра — лимфоциты — гибриды с и без добавки НАТ показывает отрицательные воздействия селекционной среды: с НАТ 23Х первичных культур Ig — отрицательно и

1 2 Э 4 5 6

Ядерно-лимфоцитные гибриды, культивировано только 40Х сильно положительно; без

HAT свьппе 70Х сильно положительно и только 4Х Ig — отрицательно °

Пример Э. Слияние клеток селезенки иммунизированной мьппи с нативными и фрагментированными клетками миеломы Ag8.653.

Человеческий стимулирующий Thyrcoi 1еа гормон.(ЬТЯ1) и его изолирован ная -цепь (P-hTSH) происходит из

Boehringer ИаппЬе ш, комплектной и некомплектной добавки Freund (CFA, IFA) Difco, метоцелий 1500 FI и КАи FITC — covaspheres von covalent

Techn. СО. Ann. Arbor. Пичиган, США.

Иммунизация: Balb/с-мыши первично иммуниэировались с помощью P --hTSH (40 мкг в CFA, интраперитонеально, 1-й день) и реиммунизировались на

196-й день с помощью hTSH (50 мкг в

IFA, интраперитонеально), на 266-й день с помощью hTSH без добавок интраперито13 14 неально, а также на 294-й день с помощью ЬТ$Н внутривенно. в

Клетки селезенки (примерно 1Х10 ) получают иэ одной из иммунизированных мьппей спустя 3 дн после последней реиммунизации, как в примере 1, п, Б.2, и используют по половине для двух слияний.

Слияние 1,.5х10 клеток Ag 8.653 смешивают, подвергают слиянию, как примере 1, п, Б.2, и культивируют в

48 24-х Tupfel ("пятен") с помощью клеток макрофагов мышей в содержащей

НАТ Д11Е?1-полной среде.

Слияние 2. 1х10 клеток Ag 8.653 подвергают лиэису, как в примере 2, благодаря постепенной обработке с помощью глицерина и 10 АМ трис-НС1буфера. Цитоплазма — мембрано-пузырьковая (СЮ) фракция гранулируется (5.000 g, 40 мин, 4 C) . Ядерная фракция смешивается с 7х 10 клеток селезенки, путем центрифугирования наслаивается на СИ7-седимент и по способу, как в примере 1, п. Б.2, посредством ПЭГ подвергают слиянию.

Продукт слияния распределяют в ДМЕМполной среде на 24-х 24-ых CostarТйрЕе1п (Costar- пятен") .с макрофагами и культивируют без добавки НАТ.

Специфическое для антигенов маркировки гибридных клеток клонирование: (FITC) Covaspheres ковалентно наносят с помощью hTSH (ТБН-CS) и хранят в

57.-ном растворе азида . натрия. Клет ки маркируют нанесенными Covaspheres и "раскладывают с помощью цитофлюорографа крупные, обладающие положительной флуоресценцией, клетки отдельно в Tupfel ("пятно") и 96-ые

Costar пластины. Пятна (Tupfel) раньше (на 24 ч) покрываются мышиными макрофагами в ДМЕМ-полной среде.

ЕЬ Т$А для Т$Н вЂ” специфических антител. Покрытие, инкубация культуральной надосадочной жидкости, реакция субстрата и отделение,как в примере 1, и. Б.2. Вместо конъюгата мышиного анти-Ig-POD применяют TSH-P0D-конъюгат. В качестве положительного контроля используют сыворотку

hTSH - гипериммунизированной мъппи, разбавленную в 10 : в качестве отрицательного контроля служит клон, антитело которого образовано против непримененного антигена (антидигоксин мьппи) °

ELISA для доказательства антиТ$Н в культуральной надосаточ" ной жидкости на 14-й день после слияния (синтеза): а) слияние

1(интактный Ag 8.653); б) слияние (синтез) 2(фрагменты Ag

8.653); отрицательный контроль (ДИЕМ-полная среда):000; положительный контроль (анти-Т$Н— мышинная сыворотка) : 362

25

1 2 3 4 5 6

236 212 149 119 212

221 119 104 176 068

108 135 139 093 135

128 120 228 137 145

А 235

В 109

С 116

D 171 б) 40

3 4 5 6

45 А 271 268 267 286 191 291

В 288 278 362 317 280 305

С 207 292

0 295 376

252 226 292 271

370 338 310 333

На 15-й день неслившиеся клетки иэ отдельных пятен слияния 1 и 2 вымывают и раздельных основаниях маркируют специфически TSH-антигеном (основание: гибридомы как правило в качестве В-лимфоцитов несут скреп24744 l4

Таким образом, как в культурах из слияния 1 (с интактными Ag8.653клетками), так и также таковые иэ слияния 2 (с фрагментами Ag 8.653лиэиса)> на 14-й день во всех пятнах появляются колонии больших лимфоидных клеток.

Результаты осуществленного на

14-й день с культуральной надосадочной жидкостью ELISA для доказательства TSH — специфических антител эксперимента представлены в табл. 4 (во всех частичных культурах прояв1$ ляется анти-TSH).

Таблица 4

15 l4 ленно часть синтезированных ими молекул антител в клеточных мембранах, вместе с направленными наружу местами связывания антигенов) и клонируют с помощью клеточного классификатора.

Пример 4, Слияние человеческого PBL с интактными и фрагментированными Ag 8.653 клетками.

Инактивированный на поверхности

Hepatisis-В-антиген (НВэ,, биотест) очищается путем иммуноадсорбции, протеинов сыворотки. EL ISA для доказательства человеческих ЕВэ -антител: пластины для микротитра покрывают очищенным EB ; (20 ед./мл, 0,9Х-ный раствор NaC1), Инкубация культуральной надосадочной жидкости, реакции конъюгата и субстрата, а также отторжение, как в примере 1, и. Б.2.

Вместо антимышиного Ig-POD используют овечий-античеловеческий Ig-POD.

НРВЕ донора с высоким анти-НВ

5 титром выделяют иэ 200 мл венозной крови путем центрифугирования по градиентам Ficoll. Для увеличения (количества) В-лимфоцитов Т-клеткам придают форму с помощью овечьих эритроцитов и отделяют розетки с помощью второго центрифугирования с градиентами по Ficoll. Фракцию необразующих розетки клеток (HPBL(В)) культивируют при плотности

5х10 клеток в R РМЕ 1640 + 10X аутологичной плазмы (активируется в течение 30 мин при нагревании до

56 С) примерно с 10 мкг НВ в СО инкубаторе (смена среды каждые 12 ч) . т

Слияние 1: 1х10 предварительно обработанного HPBL(B) смешивают с

1х10 Ag 8.653 и, как в примере

1, п. В.2, подвергают слиянию посредством ПЭГ, Продукт слияния культивируют в R РМЕ 1640 + 10X человеческой плазмы + HAT в 4-х 24-ых

Costar-Tupfeln (Costar- пятен").

Слияние 2х1, 1x10 Ag 8.653 клеб ток фрагментируют с помощью гли1 церинового лиэиса. 1x10 Ag 8.653 ядер смешивают с 1x10 HPBL(B) и наносят на седимент пузырьков мем- >

s бранной цитоплазмы (из 1x10 Ag

8.653 клеток). После слияния с ПЭГ продукт слияния культивируют в 4-х

24-ых Costar-Tupfeln в R РМЕ 1640 +

+ 10X человеческой плазмы (без добавки НАТ).

24744

1 2

3 4

А 000 000

В 000 001

45 С 005 000

000 000

011 000

000 004 б) 50

3 4

189 553

198 032

000 107

А 010 000

В 000 003

С 000 173

Во всех пятнах слияния 1 и 2 на 3-й день появляется сильный рост очень крупных слипшихся клеток.

На 5-й день основную массу не слипшихся клеток осторожно суспендируют и распределяют на две новые 24-е

Costar Tupfeln (например, в А1, Bl u

Cl). На 28-й день в слиянии 1: ма10 ленькие колонии в А2 и АЗ, в остальных пятнах только слипшиеся клетки; в слиянии 2: массивный рост множественных колоний во всех пятнах, эа исключением СЗ. Осуществленный с

15 культуральной надосадочной жидкостью на 35"-й день ELISA для доказательства человеческого иммуноглобулина со специфичностью против Hepatitis-В-антигена дает (см. табл. 5) результат:

20 слияние 1 (интактные Ag 8.653 клетки, культивирование в HAT-среде) не дает никакой положительной культуры; напротив, 5 из 12 культур слияния 2 (Ag 8.653 фрагменты, культивирование

25 в нормальной среде) отчетливо антиНВ положительны.

Таблица 5

ELISA для доказательства человеческой анти-НВэ в культуральной

30 надосадочной жидкости в день 35 после слияния: а) слияние 1 (интактный Ag 8.653); слияние 2 (фрагменты Ag 8.653); отрицательный контроль (анти-Н — отрицаэ тельная человеческая сыворотка):

:000; положительный контроль (анти-НВз — положительная человеческая сыворотка) : 185. а) 17

I 424744

Пример 5. Глияние НР1Н. с фрагментами из линии человеческой плаэмацитомы IIS SUI,TAN.

НЯ ВП TAN относится к американской коллекции типов культур (ATCC) под кодовым номером CR L-1484 в качестве криопредохраняющегося клеточного материала и оттаивается по АТСС-предписанию и культивируется.

НРВ1., как в примере 4, приготовляется одпнаковыми донорами и "реиммунизируется in vitro с НВ ..

Слияние: 4х10 IIS SULTAN клеток фрагментируют посредством лиэиса с глицерином. Пузырьковые фракции мембранной цитоплазмы седиментируют при 5500 11 (40 мин) и затем наносят смесь примерно 4х10 НБ SIJLTAN ядер

7 и 4х10 НРВ1.(В) . ПЭà — слияние осу7 ществляется по примеру 4. Посев продукта слияния осуществляется на

12 24-ных Costar-Tupfeln в R PMI

1640 + 20 FKS + пируват + инсулин (NOVO 2 ед/мл) + Ii; не основных аминокислот (ВИ) + 1Å метоцелия

1500 беэ добавки HAT.

На 14-й день после слияния: рост больших, неслипшихся лимфоидных колоний клеток.

Пример 6 ° Обессмертивание человеческих Т-лимфоцитов.

Т-лимфоциты выделяют с помощью стандартного способа (придание формы розетки с помощью овечьих эритроцитов, центрифугирование с градиентами по Р1со11) из общей фракции лимфоцитов и тотчас или после

3-дневного культивирования обрабатывают ЕЬг11сп асцитные клетки (ATCC; CCL 77) культивируют в ДИЕИ с 10 .-ной лошадиной сывороткой и они служат в качестве донора трансформирующих фрагментов, Фрагментацию

FAZ осуществляют с помсщью глицеринового лизиса. Годержащую преобладающе материал ядер фракцию отделяют путем центрифугирования и отбрасывают. Для трансформации используют обогащенную митохондриями цитоплазматическую мембрано-пузырьковую фракцию .(CHV) 5х10 Т-лимфоцитов, "нагружают" избытком РНА-лектина (Difco), смешивают с С1Я-фракцией из EAZ и инкубируют 20 мин при комнатной температуре. Смес.ь седиментируют путем центрифугирования, остаточную надосадочную жидкость удаляют и заменя5

55 ют 1 мл 507.-ного раствора ПЭГ. После мину гного воздействия ПЭà — раствор разбавляют путем добавки К РИ1-1640питательной среды и путем центрифугирования отделяют от клеток. Клетки вносят в Р PMI-среду с 20 . плодной (эародьш евой) телячьей сыворотки (FKS, ВИ), распределяют на 12 "пятен" для культивирования по 1 мл и кульо тивируют при 37 С в содержащей 57.

С0 -атмосфере. Охарактериэовывание клеток осуществляют руководствуясь поверхностными признаками посредством овечьих эритроцитов (Е) — розетирование и посредством иммунофлуоресценции при применении обоих специфических для Т-клеток антител

OKT-3 и флуоресцентно маркированного античеловеческого иммуноглобулина (Ig, фирма Дако) для доказательства типичного для В-клеток мембранного Ig.

В течение первых 14 дн большая часть клеток в культурах погибает °

На 21-й день в клеточных остатках колоний проявляются от маленьких до средних размеров клетки, которые непрерывно размножаются. Рост колоний обнаружен во всех 12 Tupfeln-"ïÿòнах", а именно вплоть до 50 колоний на пятно. На 30-й день колонии переводят в более крупные сосуды для культивирования и размножают далее.

Клетки анализируют, руководствуясь их поверхностной маркировкой, и получают следующие результаты, 7:

Е-розетки — положительные 95

OYT-3 — положительные >90

4-11 — положительные 90

Ig з — положительный : 5, Фрагменты, которые могут получаться из EAZ (перманентная линия клеток мышей) с помощью глицериновогс лизиса, после ПЭГ-слияния с изолированными Т-лимфоцитами производят перманентно растущие в культуре клетки, которые на основании их поверхностной характеристики четко идентифицируются как Т-лимфоциты.

Пример 7. Придание бессмертности человеческим клеткам эндотелия.

Все сосуды для культивирования перед посевом клеток покрывают желатиной. Питательная среда состоит из (1:1) смеси R РИ1-1640 и среды 199 (ВИ) с 20Х РК$. человеческие клетки эндотелия получают посредством раствора коллагенаэы (Cibco) иэ вен

Во всех 4-х частичных культурах подвергнутые слиянию с CNV-клетки меланомы на 28-й день вырастают в колонии типично пигментированных клеток в форме полуслипшихся клеточных груд, которые непрерывно увеличиваются. В контрольной культуре псевдослившиеся клетки не дают никакого размножения клеток, напротив, клетки на 8-й день показывают увеличивающееся гранулирование и на

22-й день в культуре наблюдают только обломки клеток.

19 14247 свежих пуповин и перед трансформацией размножаются в течение 14 дн благодаря предрасположению первичной культуры. Для трансформации растущие

5 как слипшиеся клетки эндотелия отделяют посредством растворм трипсина с

EDTA (ВИ) и в суспензии, как описано в примере 6, подвергаются слиянию с C?1V""фракцией из EAZ. Таким образом обработанные клетки высевают в сосуд для культивирования емкостью 75 см при плотности клеток 5х10э на один сосуд и культивируют в СО -инкубаторе. Для контроля при необходимости аликвотную часть клеток эндотелия из первичных культур без фракции CI1V обрабатывают ПЭГ-раствором (кажущееся слияние) и повторно культивируют, Как только клетки на дне сосуда для культивирования образуют сплошные клеточные газоны, то их отделяют с помощью трипсин-EDTA — раствора и в соотношении 1:3 переносят в свежий сосуд для культивирования (-пассаж). 25

Подвергнутые с помощью CHV-фракции слиянию клетки эндотелия после посева прилипают с эффективностью 20-307 и вырастают в течение 2-3 дн до сливающихся клеточных "газонов". Кажущиеся слившимися клетки прикрепляются примерно с одинаковой эффективностью, однако они едва размножаются, Iи в течение 21 дн полностью погибают, не образуя сливающихся клеточных

"газонов . Совершенно необработанные

lt

35 клетки эндотелия размножаются до максимальной величины при 3-м пассаже, затем рост останавливается, их освобождают при "скатывании" со дна сосуда для культивирования и подвергают лизису. В 8 различных сосудах с клетками эндотелия иэ в целом 18 различных пуповин вырастают. без всяких проблем СИ7-обработанные клетки .в течение 10-го пассажа. Трансформированные клетки эндотелия без потерь в жизнеспособности и способности к делению могут отверждаться в жидком азоте, 50

Человеческие пуповинные клетки зндотелия без трансформирующей манипуляции согласно изобретению могут культивироваться в течение не более

3-х пассажей. Путем слияния обогащен55 ной митохондриями СИ17-фракции иэ асцитных клеток Эрлиха свойства культуры клеток эндотелия изменяются так, что они без всякой проблемы

44 размножаются свыше критического 3-го пассажа (найдено, что в 23-ем пассаже клетки находятся без "явлений усталости") °

Пример 8. Придание бессмертности человеческим меланомным клеткам.

Содержащую клетки меланомы ткань получают путем хирургического иссекания метастаз подвздошных лимфатических узлов, разрезают в стерильных условиях на маленькие кубики и хранят вплоть до слияния в сжиженном азоте.

CMV-фракции из EAZ готовят, как в примере 6.

Перед слиянием содержащий меланомные клетки материал оттаивают и посредством обработки трипсином готовят суспензию из отдельных клеток, Фракцию больших, пигментированных в красно-коричневый цвет меланомных клеток путем центрифугирования с градиентами по Ficoll освобождают от сопровождающих лимфоцитов и как в примере 6 подвергают слиянию с CHV-фракцией при воэдействии ПЭГ (примерно 4х10 мела5 номных клеток с СИ7 из примерно 1х10

EAZ) . Для контролирования слияния служат 4х10 меланомных клеток, ко5 торые обрабатываются без CMV с помощью ПЭГ. Клетки после слияния высе5 вают при их плотности 1х10 на

Tupfel ("пятно") в Р PMI 1640 + 20X о

FKS и культивируют при 37 С в содержащей 5Z СО -атмосфере.

Человеческие меланомные клетки из криопредохраненной метастазной ткани путем СИ7-слияния могут трансформироваться в способные размножаться и культивироваться in vitro клетПсевдослившиеся меланомные клетки равного происхождения, напротив, по21

l4 гибают даже при идентичных условиях культивирования.

Формула и э о б р е т е н и я

Составитель Е. Калмакова

Техрер М,Дидык Корректор Л. Патай

Редактор М. Келемеш

Заказ 4702/59 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r, Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Способ получения перманентно растущих животных и человеческих клеток путем слияния нормальных жиI вотных или человеческих клеток в присутствии полиэтиленгликоля или вируса, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, нормальные животные или человеческие клетки подвергают слиянию только с кариопластамн, цитопластами, ядерной фракцией и фракцией цитоплазмы, 24744 22 обогащенной митохондриями лимфатических или эпителиальных опухолевых клеток.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю5 щ и и с, я тем, что перед слиянием кариопласты и цитопласты обрабатывают цитохалаэином, 3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что ядерную фракцию и фракцию цитоплаэмы получают путем механического разрушения или лизиса в глицерине.

Приоритет по пунктам*.

04.05.82 по пп. 1-3;

09.12.82 по п. 1.