Способ определения активности гормона тимуса

 

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - повышение точности способа. Суспензию тимоцитов и раствор гормона тимуса инкубируют. В смесь добавляют эритроциты человека 0 (1) группы крови, формируют монослой и инкубируют. Подсчитывают количество гемолитических бляшек. За единицу активности гормона принимают его количество, повышающее по сравнению с контролем киллерную активность на 50%. Способ позволяет правильно определить лечебную дозу.

Изобретение относится к медицине, конкретно к способам определения активности тимуса. Цель изобретения повышение точности способа за счет выявления активности натуральных киллеров. Способ осуществляют следующим образом. Тимус мышей любого пола возрастом 1-4 мес. измельчают на холоду в среде 199 любым подходящим способом и клеточную взвесь фильтруют через капроновую сеточку. Затем клетки дважды отмывают средой, центрифугируя при 400g в течение 5-6 мин и готовят взвесь с расчетом, чтобы в 1 мл среды содержалось 1х10⁶ лимфоцитов. Для реакции используют резус-положительные эритроциты 0(1) группы крови, которые выдерживают в растворе Олсвера неделю. Непосредственно перед постановкой реакции эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором, центрифугируя при 500g 6-7 мин и осадок эритроцитов ресуспендируют в 9 ч. (по отношению к осадку) культуральной среды. Культуральная среда состоит из среды 199 с 10% бычьей сыворотки, пенициллином (100 ед/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл). Микрокамера готовится следующим образом: на тщательно промытое предметное стекло наклеивают с трех сторон по краю тонкие полоски двухсторонней липкой ленты (толщина менее 1 мм). Оба предметных стекла перед формированием камеры стерилизуют УФО в течение 5-10 мин. Составленные камеры парафинируют с трех сторон, соответствующих наклеенным прокладкам. В центрифужные пробирки вносят по 0,1 мл суспензии тимических клеток (1х10⁵) и по 0,1 мл раствора гормона тимуса в различных разведениях. Причем одну и ту же концентрацию препарата вносят как минимум в 4 пробирки. В контрольные пробы вносят 0,1 мл среды 199. Контрольные опытные пробы инкубируют в термостате при +37^оС 60 мин. Затем клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин и ресуспендируют в 0,5 мл приготовленной эритроцитарной суспензии. Смесь тщательно перемешивают и вводят в микрокамеры. Микрокамеры герметизируют парафином и инкубируют в термостате при 37^оС в течение 19-20 ч. Учет проводят под микроскопом, подсчитывая количество образованных бляшек (Бляшка просвет в монослое, соответствующий диаметру 15-20 эритроцитов и содержащий лимфоцит). Результаты выражают в количестве НК-клеток на 0,5х10⁵ введенных лимфоцитов. Сравнивают количество НК-клеток в контрольных и опытных пробах. За единицу активности гормона тимуса принимают то его количество (в массовых единицах), которое обеспечивает приобретение натуральной киллерной активности на 50% Как видно из приведенных материалов, по предлагаемому способу можно определить 0,5 мкг ТСФ-1 в пробе. В соответствии с этим активность ТСФ-1, определенная предлагаемым способом, составляет 2000 ед. в 1 мг препарата, в то время как активность ТСФ-1, определенная известным способом, составляет 200000 ед. в 1 мг препарата. Известный способ позволяет в единицах действия оценить способность гормона тимуса превращать кортикальные тимоциты в теофиллинчувствительные Т-супрессоры. Следовательно, в гормоне тимуса оказалось в 100 раз меньше единиц активности, вызывающей созревание натуральных киллеров КН-клеток (2000 ед. в 1 мг). Следовательно, определение лечебной дозы гормона при лечении иммунодефицитных состояний, связанных с дисфункцией натуральных киллеров, только традиционным способом неизбежно к применению доз гормона, не способных оказать желаемое действие. Предлагаемый способ позволяет количественно оценить влияние гормона тимуса на созревание натуральных киллеров (2000 ед в 1 мг препарата). Применение предлагаемого способа позволяет полнее охарактеризовать функции гормона тимуса, правильно определить лечебную дозу, обосновать использование гормона тимуса для лечения первичных и вторичных иммунодефицитных состояний, связанных с дисфункцией натуральных киллеров. Способ доступен для широкого использования в лабораторной практике, прост в исполнении. Использование способа обеспечит возможность оперативного контроля им качества на всех стадиях производства и позволит стандартизовать выпускаемые серии препарата.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГОРМОНА ТИМУСА путем добавления его к суспензии тимоцитов и инкубирования смеси с последующей оценкой их функциональной активности по сравнению с контролем, не содержащим гормона, отличающийся тем, что, с целью повышения точности за счет выявления активности натуральных киллеров, после инкубирования смеси в нее добавляют суспензию эритроцитов человека 0(1) группы крови, формируют монослой, инкулируют и подсчитывают количество гемолитических бляшек, при этом за единицу активности гормона принимают его количество, повышающее по сравнению с контролем киллерную активность на 50%.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 10.09.1995

Номер и год публикации бюллетеня: 11-1998

Извещение опубликовано: 20.04.1998        

---