Способ определения количества розеткообразующих клеток

 

Изобретение относится к иммунологии . Цель изобретения поньгаение точности и упрощение способа. Дпя этого эритроциты пробы крови из пальца лизируют, добавляя на 0,5 мин дистиллированную воду, затем 10-кратный р-р Хенкса, центрифугируют при 200g 5 мин, к осадку добавляют среду 199, ставят реакции розеткообразования, фиксируют клетки фосфатным буферным р-ром, содержащим 2,0-2,5% формальдегида. Глутаровый альдегид добавляют в конечный концентрат 0,15- 0,2%. На пластмассовую пластину наносят слой белка, фиксированный метанолом , на эту пластину наносят мазок , также фиксированный метанолом, окрашивают препарат и подсчитывают клетки.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (51)4 С 01 N 33 49

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС ВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 4178390/28-1 4 (22) 06.0!.87 (46) 23; 11.88. Бюл. N 43 (71) Институт иммунологии (72) К,А.Лебедев и И.Д.Понякина (53) 615.375 (088 ° 8) (56) Лаб. дело. !983, У 9, с. 48-50. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА

РОЗЕТКООБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК (57) Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения " повышение точности и упрощение способа. Для этого эритроциты пробы крови из пальца лизируют, добавляя на 0,5 мин дистиллированную воду, затем 10-кратный р-р Хенкса, центрифугируют при

20Gg 5 мин, к осадку добавляют среду

199, ставят реакции розеткообразования, фиксируют клетки фосфатным буферным р-ром, содержащим 2,0-2,5% формальдегида. Глутаровый альдегид добавляют в конечный концентрат 0,150,2%. На пластмассовую пластину наносят слой белка, фиксированный метанолом, на эту пластину наносят мазок, также фиксированный метанолом, окрашивают препарат и подсчитывают клетки.

1 1439

Изобретение относится к иммуноло гии.

Цель изобретения - поньппение точности, упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Забирали из папьпа

О, 3 MJI KpoBH, 3pHTpoIJHtbI лизиронали путем добавления 9 мл дистиллированной воды на ЗО с, затем добавляли

1 мл 10-кратного растнора Хенкса.

Центрифугировали при 200g 5 мин, затем осадочную жидкОсть слизали к осадку добавляли 0,4 мп среды 199ь

В лунки планшета для иммунологических реакций зализали по 0,05 мл полученной суспензии клеток, затем по

0,05 мл 1%-нои суспензии эритроцитон барана или эритроцитов мьпни или кале- 20 ток пекарских дрожжей, убитых нагреванием. Планшет закрывали KpbllIIKQII H центрифугировали цри 200g н течение

5 мин. Инкубировали при 4 С н течение

30 мин. Затем в каждую лунку планше- 25 та приливали но 0,5 мл раствора, со, держащего 0,15 мп глутарового альдегида и 2% формальдегида Ia фосфатном буфере (рН 7,4). Выдерживали при кс мнатной температуре 5 мин, после че=го надосадочную жидкость стряхивали, добавляли 0,1 мп дистиллированной воды осадок ресуспендировали и делали мазки размером 0,840,8 см, Дпя мазка брали 0,025 мл полученной суспензии, Мазки делали на крышке планшета, подготовленной следующим образом„

На поверхность крьппки наносили тон) кий прозрачный слой сыворотки при

4 О помощи марлевого тампона. Сыворотку высушивали на воздухе, затем фиксировали метанолом — к поверхнос>-.и крьпп. ки плотно прикладывали лист фильт-ровапьной бумаги размером 8"10 см, который пропитывали метанолом (1,5 мл), сверху накладывали полиэтиленовую:. пленку такого же размера для уменьше1пия испарения метанола и выдерживали в течение 10 мин. Такой лист бумаги с полиэтиленовой пленкой можно хранить н герметичной посуде и ис-" пользовать несколько раз. Крьппку с фиксированным слоем белка высушивали от метанола и наносили сетку н ви55 де квадратов размером 0,9«0,9 см (всего 80 квадратов) при помощи линейки и острого предмета (например, скальпеля или иглы) . Пластина, подго50 2 тозленная таким способом, может храниться при комнатной температуре не менее 2 мес. При помощи острого предмета можно написать на пластине всю необхоцимую информацию.

Мазки нь1сушизали на воздухе и фиксирон али метанолом тем же способом, как слой белка, нанесенный на пластину ь

После высушинания пластину накрывали листом фильтровальной бумаги размером 8«10 см, пропитанным растворомм метилово го з елекого пиронина (1,5 мл краск|л), сверху Hакладь,вали лист полиэтиленоной пленки такого же размер а ь Выдерживали 20 :плн, Такой лист бумаги с полиэтиленовой пленкой„ пропитанный раствором краски, можно хранить з герметично "-,àêðbIãoé посуде и использовать несколько раэ.

Окрашенньгй препарат высушивали на воздухе,, Затем на поверхность капали

10-12 капель иммерсионного масла (н общей сложности 1 мл), HaKpbIHaJIH прозрачной целлофановой пленкой размером

8«10 см, пленку разравнивали при помоши тампона из марли так. чтобы под ней не Остакалось пузырьков воздуха.

Препарат FoToE к микроскопиронанию.

Пример 2.,В кажцую лунку планшета, содержащего осадок розеток и клеток, полученный так, как описано з примере l приливали по 0,05 мл раствора, содержащего 0,20 мп глутаро ного альдегида и 2,5% формальдегида на фосфатном буфере (рН 7„4).

Выдерживали при комнатной температуре 5 мнн> затем надосадочную жидкость стряхивали, Осадок ресуспендиронали и делали мазки размером 0,8

«0,8 см из 0,025 мл полученной суспенэии. 11азки делали на крышке планшета для иммунологических реакций, подготовленной так же, как описано E примере 1. Все остальные операции делали так же, как в примере l, с той лишь разницей, что н качестве белка и с пол ьз о н али б ело к яйца.

Предлагаемьал способ позволяет сущестненно повысить точность опрецеления количества розеткообразующих клеток, поскольку мазок на пластмассу, покрытую слоем белка, ложится ровно,. без конгломератов, а дозированное количество суспензии клеток при четко ограниченной площади мазка (0,8 "

"0,8 см) позволяет получать мазки одинаковой тогапины, з 141ч59 с

Предлагаемый способ позволяет получать мазок более однородный, чем известный, что выражается в догтозерном (P 0,001) и существенном (в

Г среднем в 5,6 паза) уменьшении количества выявленных конгломератов.

Увеличение однородности мазка приводит к повышению точности получаемых результатов, поскольку просчет позе- 10 ток в конгломератах приводит к получению искаженных результатов, Повышение точности результатов по предлагаемому способу в сравнении с известным выражается в уменьшении 15 разности между максимальным и минимальным значениями F.-POK, полученными в результате просчета трех случайно выбранных полей одного и того же препарата, а также вследствие этого 20 уменьшения среднеквадратической ошибки m (в 1,28-8,4 раза) просчета трех случайно выбранных полей одного и того же препарата. Кроме того,предлагаемый способ приготовления препара- 28 тов имеет большие преимущества по сравнению с известным и з затратах труда и материалов.

Затраты материалов, необходимые при реализации предлагаемого способа, ЗО значительно меньше, чем затраты материалов в результате приготовления препаратов по известному (базовому) способу, в предлагаемом способе вместо предметных и дефицитных покровных стекол применяется крышка планшета, которую ранее выбрасывали после ис" пользования планшета, и целлофановая пленка, которая дешева и доступна. Кроме того, имеется экономия, 40 растворителей, краски, отпадает необходимость наличия станка для шлифовки стекол, Существенное значение имеет уменьшение количества глутарового альдегида, который является 45 т ок сичным в еще ств ом.

Испольэов ание предлагаемого способа требует значительно меньше растворителей, в частности метанола., не требует этанола, диэтилового эфира и ксилола (необходимого для растворения канадского бальзама), что само по себе представляет не только экономию, но и улучшение условий труда вследствие уменьшения контакта работающего с растворителями. !

В предложенном спе-..обе уменьшается количестве используемого глутарового альдегида в 5-20 раз, что также дает экономию дефицитного реактива и суше стненно улучшает условия труда, госкольку глутароный альдегид является ядовитым, летучим веществом.

Замена основной :асти глутарового альдегида не представляет трудностей поскольку фомачьдегид широко доступен„ так как формалин широко используют в гистологии, и пары формальдегица нетоксичны.

Улучшение условий труда в предлагаемом способе состоит также в отсутствии необходимости шлифовки стекол для нанесения на них надписей(в результате че-.о образуется стеклянная пыль, проникающая в легкие), так как надпись на пластмассе легко сделать острым предметом, Затраты труда. на осуществление предлагаемого способа меньше, чем на осуществление известного. При обследовании 100 человек манипуляцией с

5 крышками планшеток и 5 прямоуголь" никами целлофанз меньше, чем с 200 предметными и 400 покровньп и стеклами ..

Кроме того, при использовании крышек планшетов пслностью исключается необходимость мытья, шлифовки и обезжиривания большого количества стекол.

Бсе это сокращает время приготовления препаратов при обследоварни 100 человек в 3 раза.

Фо р мул а из о бр ет е ни я

Способ определения количества розет" ксобразующих клеток, включающий постановку реакции розеткообраэования, фиксацию клеток фосфатным буферным раствором, содержащим глутаровый альдегид, приготозление мазков, их окрашивание и подсчет клеток, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, фиксацию клеток осуществляют раствором, дополнительно содержащим 2,02,5Х формальдегида, глутаровый альдегид добавляют в конечный концентрат 0,15-0,27,, а мазки готовят на пластмассовой пластине с предварительно нанесенным слоем белка, фиксирован" ным метанолом.

В 1{,1;1П.1 3 ак аз 6071 /44 Тираж 847 Подписное

Г1роиэн.-полигр. пр — тие, г.

Ужгород, ул. Проектная, 4