Штамм бактерий кurтнiа zopfii-продуцент рестрикционной эндонуклеазы кzо 91
9 А1
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (1Q) (И) (S11 4 С 12 N 9/16
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
И А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4215163/28-13 (22) 23.03.87 (46) 30,11.88, Бюл. 11 44 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии и Институт микробиологии и вирусологии АН КазССР (72) С.Х.Дегтярев, Н.И.Речкунова, О.А,Жилкина, Г.В.Семенченко и М.И.Новожилова (53) 577.15(088.8) (56) Gelinas К.Е., Myers Р.A., Roberts R.I. Two sequence. — specific
endonucleases rom Могахе11а bovis.Х. Мо1. Biol. - 1977, v. 144, 169-179.
SussenÚàñh I.S.Monfort С.M. А restriction endonuclease from Staphylococcus suerus. Nucl. Acids Res, 19?б,,v. 3, р. 3193-3202. г (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ KURTI ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКЦИОННОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗК Као 91 (57) Изобретение относится к микробиологии, и частности к получению штаммов — продуцентров рестриктаз и представляет собой штамм Kurthia zophii 9, продуцирующий рестриктазу Kzo9 1, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов GATC. Цель изобретения — выявление штамма, обеспечивающего упрощение и удешевление процесса получения рестриктазы, обладающей способностью узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов БАТС. Выход фермента составля- Я ет 2500 ед/г биомассы, удельная активность 10000 ед/мп. 1440919 Изобретение относится к микробиологии, в частности к получению штаммов — продуцентов рестриктаэ. Цель изобретения — выявление штам5 ма, упрощение и удешевление процесса получения его рестриктазы, обладающей способностью узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GATC. Изобретение предусматривает исполь-10 зование непатогенного штамма Kurthia Zopfii 9 ВКПМ В-3668 — продуцента рестриктазы, культивирование проводят в питательной среде LB при 30 С в условиях аэрации, клетки разрушают уль- 15 тразвуком, затем проводят хроматографическую очистку фермента. Используемый штамм Kurthia zopfii 9 выделен в результате поиска штаммов — продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в Аральском море, и хранится в ВКПМ ВНИИ генетики под регистрационным номером В-3668. ! Штамм обладает следующими морфологическими, культуральными и физиологическими свойствами. В молодых культурах (18-24 ч) правильные неразветвленные палочки 20 с закругленными концами, встречаются в цепочках, которые часто параллельны, диаметр палочек около 0,8 нкм, длина часто варьирует в зависимости от стадии роста, но обычно 2-8 мкм. Старые культуры (3-7 дней)состоят из . кокковидных клеток, образованных при фрагментации палочек; палочки движут ся при помощи перитрихальных жгутиков. Эндоспор не образуют. Грамположительные, некнслотоустойчивые хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный, не бродильный. Каталазоположительные, оксидазоотрицательные, Не восстанавливают нитраты. Не образуют кислоту из углеводов или многоатомных спиртов, подщелачивают среду. С рогие аэробы. Температурный оптимум 2530 С, пределы 5-37 С. Хороший рост в присутствии 4-6 NaC1. Полученная рестриктаза характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов GATC; оптимальное значение рН для действия рестриктаэы 7,5-9,0; оптимальная температура действия 37 С; для активности рестриктазы требуются ионы Мр; оптимальная концен2 трация 5-15 мМ. Пример, Получение рестриктазы Kzo 9 1 иэ Kurthia zopf ii 9. Клетки Kurthia zopfii 9, хранящиеся в 50Z-ном глицерине в L-бульоне (LÂ) состава, r. триптон 10, дрожжевой экстракт 5, NaC1 10, вода до 1 л при о 20 С, высевают на чашку с L-агаром. После 2 сут инкубирования при 30 С клетки собирают петлей и вносят в I00 мп LB и выращивают до плотности 1,5 при 30 С. Затем культуру вносят в 2 л ЬВ и выращивают до плотности 2,5 при 30 С. После охлаждения клетки собирают центрифугированием. Выход биомассы 2 r сырого веса с 1 л среды. 4 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 M буфера трис-НС1, рН 7,5, соз держащего 10 М,6 -меркапто этанол и 0,1Х-ный тритон Х-100 и разрушают на ультразвуковом дизинтеграторе, Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при 4 С) и надосадочную жидкость наносят на 30 мл фосфоцеллюлозы P-11 (Whatman), уравновешенной буфером А (0,02 М K-фосфат, рН 7,5, 0,001 Мр -меркаптоэтанол, 5 10 М ЭДТА), и затем колонку промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюируют раствором 1 М NaC1 в буфере А. 60 мл полученного смыва белков с колонки диализуюу ночь против 2 л буфера А и затем наносят на 1О мл ДЕАŠ— целлюлозы (ДЕ-52, Mhatman, Англия), уравновешенной буфером А, и элюируют 100 мл градиент 0-1,0 M NaCl в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл. Аликвоты из каждой фракции (1 мкл) о инкубируют 1 ч при 37 С с 1 мкл ДНК фаза Л и анализируют в геле агароэы. Фракции, расщепляющие ДНК фага (811), объединяют, диализуют 3 ч против 2 л буфера А и наносят на 4 мл фосфоцеллюлозы P-11 (Mhatman, Англия) и элюируют 40 мл градиент 0-1,0 в буфере А, Объем каждой фракции 2 мл ° Фракции, содержащие Кяо 9 1, определяют так же, как при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Фракции 12-13, со— держащие Kzo 9 1, объединяют и диализуют против буфера А, содержащего 0,1 М NaC1 и 501-ный глицерин. Полученный препарат фермента (1 мл) имеет удельную активность 10000 ед/мл., Со став ит ель Н, Ходар е в Редактор М.Недолуженко Техред И.Дидык Корректор Г Ренетник Заказ 6141/28 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб ., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ! 3 144 За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления мкг ДНК фага Л в течениб 1 ч при 37 С. Ферментный препарат хранят при -20 С. Hs 1 r биомассы получают 2500 единиц рестриктазы Kzo 9 1, Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Kzo 9 !. Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Кйо 9 1, проводят Гидролиз Ê фага Л рестриктазами Kzo 9 1, eau ЗАТ по отдельности, а также .совместный гидролиз этими рестриктазами. Наблю0919 4 даемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролиэе ДНК рестриктаэами Kzo 9 1 и Sau 3A1 порознь и совместно, указывает на 5 то, что рестриктаэа Kzo 9 1 является изошиэомером рестриктаэы Ран 3AI,узнает и расщегляет последовательность нуклеотидов САТС. Рестриктаэа из Kurthia opfii 9 названа Kzo 9 согласно общепринятой номенклатуре. Формула изобретения Штамм бактерий Kurthia zopfii 9 ВКПМ В-3668 — продуцент рестрикциокной зндонуклеазы Kzo 9 1.
