Способ получения кристаллов карбоксипептидазы т

 

Изобретение относится к способу получения кристаллов карбоксипептидазы Т, основанному на использовании . метода диффузии паров растворителя. К ферментному раствору в МЕ8-бу$ёре , добавляют сульфат аммония, 2-мётилпентандиол-2,4 (МПД) и сернокислый цинк. В качестве насыщающего раствора применен раствор аналогичного состава с концентрацией сульфата аммония от 33 до 37%. Процесс кристаллизации ведут путем помещения капли ферментного .раствора, нанесенной на Iсиликонированное стекло, в герметич- i ную камеру с насыщающим раствором, содержащим сернокислый цинк, MES- буфер, МПД и сульфат аммония. 1 ил. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (я) 4 С 12 N 9/48, С 07 К 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО.ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4235098/31-13 (22) 24.04.87 (46) 07,12.88. Бюл. ¹ 45 (71) Институт кристаллографии им. А.В.Шубникова (72) И.П.Куранова и Г.В.Обмолова (53) 577. 15(088.8) (56) Pherson А.Мс. Preparation

and Analysis of Protein Crystals, John Waley and sons. New Jork

Chichester Brislane Toronto Singapore, 1982, р. 94.

Остерман А.Л. и др. Карбоксипептидаза Т вЂ” внеклеточная карбоксипептидаза термоактинОмицетов— отдаленный аналог карбоксипептидаз ,животных. — Биохимия, 1984, т.49, №- 2, с. 292-301. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРИСТАЛЛОВ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Т ! (57) Изобретение относится к способу получения кристаллов карбоксипептидазы Т, основанному на использовании метода диффузии паров растворителя.

К ферментному раствору в MES-бу ере: добавляют сульфат аммония, 2-метилпентандиол-2,4 (ИПЛ) и сернокислый цинк. В качестве насыщающего раство" ра применен раствор аналогичного состава с концентрацией сульфата аммония от 33 до 377. Процесс кристаллизации ведут путем помещения капли ферментного раствора, нанесенной на

Ф % ,силиконированное стекло, в герметич- Я ную камеру с насыщающим раствором, содержащим сернокислый цинк, MESбуфер, ИПД и сульфат аммония. 1 ил.

1442547

Изобретение относится к молекулярной биологии, точнее к белковой кристаллографии, и может быть использовано при исследовании пространст- 5 венной структуры изучаемого белка методом рентгеноструктурного анализа.

На чертеже представлено устройство для осуществления способа.

Способ получения кристаллов карбо- 10 ксипептидазы Т с пространственной группой Рб> 22 с параметрами ячейки

a=b=159,4 Л c=106,9 А и углами Ы P= о

= =90 заключается в следующем. Капли раствора фермента в растворе, содержащем осадитель - сульфат аммония, MES-буфер, 2-метил-пентандиол-2,4, на носят на поверхность силиконированного стекла, объем капель 10 — 30 мкл.

Стекло помещают в чашку Петри с пред"20 лагаемым раствором, причем осадитель в более высокой концентрации — насыщающий растор. Края -чашки Петри смазывают вакуумной смазкой и накрывают

:,стеклом, чтобы образовалась герметич- 25 ная камера (фиг.1). Для большей герметичности на поверхность стекла помещают груз, например, в виде стального диска. В такой камере первоначальный объем белковых капель уменьшается за счет перегонки паров растворителя из капли в насьпцающий раствор. Эта перегонка продолжается до тех пор, пока не уравновесятся концентрации фермента и осадителя в капле и в насьпцающем растворе.

Вызванное этим увеличение концентрации фермента приводит к выпадению его в виде аморфного или кристаллического осадка.

При указанных в предлагаемом спо" собе условиях выращивают изометричные, хорошо ограненные,i кристаллы в форме гексагональных бипирамид, достигающие размеров 0,8х0,8х0,7 мм.

По данным рентгенографического исследования кристаллы карбоксипепти- дазы Т имеют параметры элементарной . о о ячейки a=b=159,4 Л, с=106,9 А. Они принадлежат к пространственной группе Р6 22. Для полученных кристаллов собран набор интенсивностей дифракционных отражений с разрешением 3 А.

Условия кристаллизации карбокси" пептидазы Т разработаны на основе следующих экспериментальных данных.

Опыты по выращиванию укаэанных кристаллов проводят в MES-буфере в интервале рН 5,0-8,0 (интервал устойчиности фермента) при концентрациях фермента 0,5 — 2,0% с использованием в качестве осадителя полиэтиленгликоля, сульфата аммония, 2-метилпентандиола-2,4 (МПД), в отсутствии и в присутствии ионов цинка.

Условия роста следу|ощие. Концентрация фермента и растворе 1,0 — 1,2%, рН раствора 5,9 — 6,2, Осадитель сульфат аммония. Концентрация осадителя в ферментном растворе 10%, в насыщающем растворе 33 — 37%. Концентрация сульфата цинка в ферментном растворе 1х10 — 3x10 И, Температура 40

25 С. Время роста кристаллов — тричетыре недели.

В указанных условиях кристаллы вырастают достаточными по величине, однако значительная часть белка кристаллизуется в виде игольчатых друз.

Введение в ферментный и насьпцающий растворы 131Д концентрации 3% подавляет рост друз, и фермент кристаллизуется в виде гексагональных бипирамид, . Увеличение концентрации сульфата аммония как в ферментном, так и в насьпцающем растворах за указанные пределы приводит к увеличению числа кристаллических зародышей и, тем самым, к уменьшению размеров выращенных крис-таллов. При уменьшении концентрации сульфата аммония ниже указанного значения роста кристаллов не происходит.

П р и и е р 1. Препарат карбокси. пептидазы Т хранят в осажденном виде в 80%-ном сульфате аммония. 5 мл суспензии фермента в сульфате аммония центрифугируют при 12 тыс. об/мин, осадок растворяют в 300 мкл 0,05 И

MES-буфера рН 6,0. B течение 24 ч отдиализовывают против 250 мл этого же буфера, центрифугируют раствор при 12 тыс. об/мин, сливают прозрачный раствор. Объем раствора 400 мкл.

Измеряют оптическую плотность раствора при 280 нм на спектрофотометре, рассчитывают концентраци|о белка, принимая оптическую плотность 0,1%-ного раствора за единицу. Оптическая плотность А=14, следовательно, концентрация белка 1,4% °

К 400 мкл полученного раствора карбоксипептидазы Т добавляют

15,б мкл ИПД, 53 мкл 4М раствора сульфата аммония и 53 мкл раствора Z

ZnS0 с концентрацией 1х10 11, Суммарный объем раствора 521,6 мкл, 144

45Формула изобретения конечная концентрация фермента

10,8 мг/мл, т.е. 1,08%.

Полученный раствор каплями .по

20 мкл наносят на стекло, которое помещают в чашку Петри с 10 мл раствора, содержащего, мл: сульфат аммония

3 5 МПД 0,3; 0,05 И МЕЯ-буфер (pE1 6,0) 6,2.

Чашку герметизируют по описанному методу и оставляют при комнатной температуре. Через 3 недели в каждой капле образовываются кристаллы в виде ограненных гексагональных бипирамид размером до 0,8х0,8х0,7 мм.

Пример 2. 4 мл суспензии фермента в сульфате аммония отцентрифугируют, как в примере 1, растворяют в 200 мкл 0,05 И NES-буфера рН 6,2, отдиализовывают раствор против

200 мкл этого же,буфера, центрифугируют, сливают прозрачный раствор. Объем раствора 300 мкл. Измеряют концентрацию фермента, как описано выше:

A=15, концентрация карбоксипептидазы

Т 1,5 .

К 300 мкл раствора добавляют

12 мкл МЦД, 40 мкл 4М сульфата аммония и 40 мкл 2х10 И раствора ZnS0<.

Суммарный объем 392 мкл. Конечная концентрация фермента 1,15 .. Полученный раствор каплями по 25 мкл наносят на стекло, как описано выше, которое помещают в чашку Петри. В чашке Петри предварительно помещают 10 мл раствора, содержащего, мл: 4М сульфат аммония 3,3; ИПД 0,3; 0,05 М ИЕБ †буф (рН 6,2) 6,4, далее аналогично примеру 1. Через 4 недели получают кристаллы размером от 0,6х0,6х0,5 до

0,8х0,8x0,7 мм.

Далее приведены примеры, свидетельствующие о существенном влиянии на размер и форму кристаллов концентрации сульфата аммония в ферментном и насьпщающем растворах, а также о влиянии концентрации фермента и наличия ионов цинка и МПД, Пример 3. 7 мл суспензии обрабатывают, как описано выше. Конечный объем ферментного раствора

650 мкл, концентрация белка 13 мг/мл. .I(160 мкл полученного раствора добавля ат 40 мкл 4 М раствора сульфата аммония. Конечный объем 200 мкл, концентрация сульфата аммония 20, концентрация белка 10,4 мг/мл.

I I

Ферментный раствор в виде капель наносят на силиконированные стекла, 2547 как в предыдущих опытах. В чашку Петри помещают 4 мл 4 N сульфата аммония и 6 мл 0,05M NES-буфера рН 6,0.

Через две недели в каплях образовываются длинные игольчатые кристаллы, собранные в друзы. Кристаллы мелкие, для дальнейших исследований не пригодны.

10 Пример 4. Тот же ферментный раствор, что и в предыдущем опыте, наносят в виде капель на стекло, которое помещают в чашку Петри с насыщающим раствором (3,5 мл сульфата

15 аммония и 6,5 мл NES-буфера), т.е, концентрацию сульфата аммония в насыщающем растворе снижают до 35 .

Через четыре недели в растворе образовываются кристаллы двух видов:

20 игольчатые друзы и мелкие ограненные кристаллы в виде гексагональных бипирамид, также не пригодные для исследований.

Описанные эксперименты (примеры 3

25 и 4) по кристаллизации карбоксипептидазы Т проводят без добавления ионов цинка и МПД.

Пример 5. К 164 мкл ферментного раствора концентрацией 14 »r/ìë, 3Q как и в предыдущих опытах, добавляют, мкл: МПД 14; 4 И сульфат аммония (15) 69; раствор 10 И

ZnS0< 46; 0,05 N NES-буфера (pH 6)0)

167. Конечный объем ферментного раствора 460 мкл, конечная концентрация белка 0,5 .

В качестве насыщающего раствора используют 3,9 мл 4 If сульфата аммония и 6, 1 мл 0,05 М NES-буфера рН д0 6,0. Через четыре недели в каплях вырастают ограненные кристаллы в виде гексагональных бипирамид, но размер их не превышаег 0,3х0,3x0,2 мм.

Способ получения кристаллов карбо1 ксипептидазы Т характеризующихся пространственной группой Р бр22 с пара50 метрами ячейки а=Ь=159,4 Л; с= о

=106,9 А и углами d=(=(=90, заключающийся в том, что из исходной суспензии фермента в сульфате аммония отделяют фермент центрифугированием, растворяют его в 0 051 МЕБ-буфере с рН 5,9...6,2, проводят диализ против этого же буфера и разбавляют раствор до концентрации фермента

1,3...1,5/, к полученному раствору

Капли рерменщна о рц ц " @ ® 4

/" Чашщйетри

Фаыщ

4м ри

Солаконираданное свекла

Составитель И.Привалова

Редактор Н.Гунько Техред М.Дидык Корректор С.Шекмар

Подписное

Тираж 520

Заказ á355/23

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1442547 6 добавляют водный раствор сернокисло- мента наносят на поверхность силикого цинка до концентрации 1...3 -10 М нированного стекла в виде капель и затем 4М водный раствор сульфата помещают в герметичную камеру с,нааммония до концентрации 107. и 2-ме- сыщающим раствором, содержащим сертил-пентандиол-2,4 (ИПД) до концент- нокислый цинк, MES-буфер, МПД в тех рации ЗЖ с достижением при этом же концентрациях и сульфат аммония конечной концентрации фермента 1... в концентрации 33 — 377., процесс о

1,2 мас.7., полученный раствор фер- кристаллизации ведут при 5 — 25 С.