Способ определения сахаролитической активности микробов

 

Изобретение относится к области микробиологии и предназначено для быстрого определения сахаролитической активности микробов при их идентификации . Для повышения чувствительности способа на поверхности бумажного диска с гидрофобным покрытием размещают углеводные субстраты и индикатор в виде фиксированных энзимоиндикаторных микропленок, содержащих дополнительно гидролизат казеина сухой и желатин при следующем -соотношении компонентов, мас.%: субстрат углеводный 2-3; гидролизат казеина сухой 0,9-1,5; желатин 0,9-1,5; феноловый красный 0,01-0,025; фосфатньй буферный раствор рН 8,0 остальное. 3 табл.Q «

СО103 СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 С 12 q 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ABTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

C ф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО.ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4232569/28-13 (22) 20.04.87 (46) 07.12.88. Бюл. № 45 (71) Кишиневский государственный медицинский институт (72) Ф.И.Георгица и В.М.Никитин (53) 576.8.093(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 548623, кл. С 12 Q 1/00, 1977.

Авторское свидетельство СССР № 707963, кл. С 12 Q 1/04, 1980. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИКРОБОВ (57) Изобретение относится к области микробиологии и предназначено для быст„„SU„, 1442549 А1 рого определения сахаролитической активности микробов при их идентификации. Для повышения чувствительности способа на поверхности бумажного диска с гидрофобным покрытием размещают углеводные субстраты и ин" дикатор в виде фиксированных энзимоиндикаторных микропленок, содержащих дополнительно гидролизат казеина сухой и желатин при следующем соотношении компонентов, мас.Х: субстрат углеводный 2-3; гидролизат казеина сухой 0,9-1,5; желатин 0,9-1,5; феноловый красный 0 01-0 025; фосфатный буферный раствор рН 8,0 остальное.

3 табл.

1442549

Изобретение относится к микробиологии и предназначено для определения сахаролитических свойств микробов, Целью изобретения является повыше5 ние чувствительности способа.

Способ заключается в том, что на поверхность бумажного диска с полимерным покрытием размещают углеводные субстраты и индикатор в виде энзимоиндикаторных микропленок, которые дополнительно содержат гидролизат казеина сухой, а в качестве фиксирующего вещества — желатин при следующем соотношении компонентов, мас. : углеводный субстрат 2-3; гидролизат казеина сухой 0,9-1,5; желатин 0,91,5; феноловый красный 0,01-0,025; фосфатный буферный раствор рН 8,0 остальное. 20

Включенный в состав микропленки углеводный субстрат используют в качестве ферментируемого субстрата, феноловый красный играет роль индикато" ра рН реакции, осуществляемой сахаро- 25 литическими ферментами микробов при использовании ими углеводных субстратов. Желатин фиксирует на поверхности бумажного диска с полимерной пленкой субстраты и индикатор и вмес- 30 те с гидролиэатом казеина одновреиенно служат питательными веществами, за счет которых происходят рост, размножение микроорганизмов, сахаролитических ферментов и их определения.

Это позволяет повысить чувствительность и ускорить определение, что приводит к быстрому накоплению сахаролитической активности микроорганизмов до 7 ч при концентрациях от

1 млрд.-1 млн. и до 18-24 ч при концентрациях до 10 микробных клеток в 1 мл.

Чувствительность и скорость определения сахаролитической активности микробов в предлагаемом и известном способах приведены в табл. 1.

Способ осуществляют следующим образом.

К навескам углеводородного субстрата и гидролизат казеина сухой приливают растворы желатина, фенолового красного и фосфатного буферного рН

8,0, затем растворяют смесь на водяной бане при 90 С и получают субстрйтно-индикаторно-фиксирующий раст55 вор. Полученный и охлажденный до комнатной температуры раствор наносят н@ поверхность диска с полимерным покрытием в виде капель объемом 0,02 мл, которые высушивают до получения фиксированных энзимоиндикаторных микропленок. Для определения сахаролитической активности микробов на энзимоиндикаторные микропленки наносят по 1 капле исследуемой микробной культуры и термостатируют при 37 С.

Пример 1. Из бумаги .с полимерным покрытием вырезают диск диаметром чашки Петри и расчерчивают

20 квадратных зон площадью 1,5х х1,5 см.

В пробирку берут навеску соответствующего углеводного субстрата (0,25 г) и гидролизат казеина сухой (0,1 г) и к ним приливают растворы

10 -ного желатина 1,0 мл, 25 .-ного фенолового красного 1,0 мл, фосфатного буферного рН 8,0-7,7 мл и растворяют смесь на водяной бане при 90 С, получая субстратно-индикаторно-фиксирующий раствор, который охлаждают до комнатной температуры, Затем в центр каждой квадратной зоны диска наносят пипеткой по 1 капле объемом

0,02 мл субстратно-индикаторно-фиксирующего раствора соответственно обозначению углеводного субстрата и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания. капель и получения фиксированных энзимоиндикаторных микропленок.

Готовый диск с фиксированными микропленками хранят при комнатной температуре в бумажных пакетах в течение

3 лет (срок наблюдения) . По мере надобности их используют для определе ния сахаролитической активноу1 и мик о. робов. С этой целью в крышку чашки

Петри кладут готовый диск и на энзимоиндикаторные микропленки наносят пипеткой по 1 капле микробной взве-. си, содержащей от 1 млрд, до 10 микробных клеток в 1 мл. Чашку закрывао ют и инкубируют при 37 С.

При расщеплении субстрата микробной культурой окраска капли переходит из красного цвета в желтый.

Способ определения сахаролитической активности микробов осуществляют использованием энзимоиндикаторных микропленок, приготовленных из ингредиентов в пределах указанных граничных значений.

Пример ы 2-9. Опыты проводят аналогично примеру 1.

От 0,9 до 1,5

От 0,9 до 1,5 микроорганизмов, Таблица!

Скорость ферментации углеводных субстратов, ч,, по способу

Концентрация ,микробов, в1мл предлагаемому известному

,1 1.1:7 1, .1 Т ..Т; I Т:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 24 1/2+ 34 (vto J2 j a 9 24

1О

10а

+ +

+ + + +

+ + +

+ +

+ 4 +

+:4 +

+ + +

П-р м е н а н и е: "+"- полояительная реакция, "-" - отрицательная реакция. з 144

Зависимость чувствительности способа от количественных соотношений компонентов энзимоиндикаторных микропленок показана в табл. 2.

Предлагаемы способ является более чувствительным, так как позволяет определить сахаролитическую активность микробов при концентрациях до

10 микробных клеток в 1 мл (табл.1).

Это дает возможность изучить сахаролитическую активность микробной колонии, исключив этап накопления при выделении чистой культуры.

Сахаролитическая активность раз- . личных микробов показана в табл.3.

Кроме того, способ позволяет конструировать целенаправленные микротекстсистемы определения сахаролитической активности различны: групп

Формула и з о б р е т е н и я

Способ определения сахаролитической активности микробов, предусмат2549

4 ривающий размещение исследуемого образца на бумажном диске с полимерной пленкой, приготовленной с использованием углеводных субстратов, индикато5 ра — фенолового красного, фиксирующего вещества, растворенных в фосфатном буфере рН 8,0, с последующей оценкой результатов, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, для приготовления полимерной пленки дополнительно вводят гидролизат казеина сухой, а в качестве фиксирующего вещества используют желатин при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Углеводный субстрат От 2,0 до 3,0

Гидролизат ка20 eHHÂ сУхой

Желатин

Феноловый красный От 0,01 до 0,025

Фосфатный буфер2ц ный раствор рН 8,0 Остальное

1442549

Таблица2

Компоненты энэимоинликаториой микропленки и их соотнопе елъность способа при ациях микробов

Пример

Желатин убстрат каэейна сухой ° поло вый асный

Утлеводиый страт клеток/мл

1 млн/мл абс. X бс. I абс.

0,3

0,3

0 5

0,3 0,3

0,001 0,001

0,0025 0,0025

0,5

2 1 0

O 5 . 0>5 0 5

0 5

0,8 0,8 0,8

0,8

3 1,5

4 2,0

5 2 5

>1,5

0,005 0,005

+++

0 9 0 OT 0,01

0,9

2,0

0,9 0 9

+++ ч++

+и

2,5

1,0

0>02 .0>02

1,0

1,0

+++

+++

0,025

6 3 0 . 3 0 1,5

1,5

1,5

1>5

0,025

+н

+++

1,75 1,75 1,75 0,03

3,5 .

7 3,5

1 75

0,03

3,75 2,0

0,05

8 3,75

9 4,0

2,0

2,0

2,0

0 05

2,5

4,0

2,5

2 5

2,5

0,075

0,075

П р н и е ч а и и е. Кнтенсивность реакцинэ "+++" - резко полоиителъная (иелтый цвет)> "++" - полопительная (светлоиелмый), "+" - слабополошпелъная (орапиевый), "-" отрицательная (красный).

ТаблицаЗ

Углеводный субстрат

l t 1 !

Род, вид микробов

typhimurium

Citrobacter 117

S.aureus 209-р

Uibrio Mecnicov

S.epidermidis

P.aeruginosa

II р и M е ч а н и е. "+" — положительная реакция, "-" — отрицательная реакция.

Escherichia coli 055

Shigella connei 1669

S.abortus bovis

S.sholerae suis

Entегоbacter 447

P.mirabilis 226

Klebsiella

Глюкоза Лактоза Мальтоза Сахароза Ианнит