Способ экстракции лизосомальных ферментов
СОЮЭ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АBTÎPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР (21) 4200182/28-13 (22) 24.02.87 (46) 07.01.89. Бюл. N - 1 (71) Новосибирский медицинский институт (72) А. Б. Пупьпцев (53) 663. 15 (088.8) (56) Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосоми. — М.: Наука, 1976. Bohley P. Kirscke Н., Langner I. Ansorge S. Preparative gevinnung hochgereinigter 1.ysosomenenryme aus ratten leben. — РЕВЯ J.ett. 1969, 5, р.233. ÄÄSUÄÄ 1449580 А1 (54) СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ЛИЗОСОМАЛЪНЫХ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам очистки ферментов. Целью изобретения является упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта. Способ предусматривает дифференциальную экстракцию лизосомальных ферментов из грубооч пценного препарата митохондриальномукомольной субклеточной фракции в присутствии дигитонина в концентрациях 0,3-0,4 мМ. 2 ил., 2 табл. 1449580 Таблица1 ОтносительСодержание активности, от содержания в гоФерменты ная удельная активность могенате печени 31,2 1,1 Белок Кислая фосфатаза 63,5+4,4 2, 06+0, 18 Кислая РНКаза 1в93+0>16 61,6+4,8 Р-галактозидаза 2.,24+0,08 70,6+3,1 Цисте" иновые катепси84,5+3,4 2,22+0)13, ны Катепсин D 80,7+4,3 2 73+0 27 Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам очистки ферментов. Цель изобретения — ускорение и 5 уйрощение способа и увеличение выхода целевого продукта. На фиг.1 и 2 представлены графиМ, поясняющие предлагаемый способ. Способ заключается в выделении большей части клеточных лизосом в с ставе митохондриально-лизосомальной ф акции гомогената печени, получаем и достаточно просто и быстро метод м дифференциального центрифугирова- 15 н, с последующим использованием о обенностей химического состава ли3 сомальной мембраны, которая B сравн нии с мембранами других .органелл, в частности митохондрий, обогащена х лестерином. Способностью к специфич скому связыванию с холестерином (очнее с 3,)-.оксистероидами) с по. с едующей лабилиэацией мембраны обла,д ет стероидный гликозид дигитонин. П и этом чувствительность лизосом к д гитонину максимальна среди всех основных цитоплазматических структур и наиболее существенно отличается от таковой митохондрий. Пример. 1. Печень животных,. уйерщвленных декапитацией, перфузи-, р ют холодным раствором 0,25 М сахаррзы, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4 (стандартный раствор сахарозы — CPC). Гомогенат т ечени (ткань: среда 1:3) подвергают центрифугированию (700 g, 13 мин). Осажденную ядерную Фракцию промывают дважды ресуспендированием в 15 мл олодного СРС с последующим переосаждением частиц при 700 g 11 мин. Объединенный супернатант центрифуги-! уют на препаративной центрифуге К-70 ("Янецки", ГДР) со скоростной насадкой при 13600 об/мин (13000 о) ! 1 мин„ Осадок митохондриально-лиэоомальной фракции промывают ресуспендированием в !5 мл CPC и повторным осаждением при !3600 об/мин, 11 мин. Конечный осадок суспендируют в 15 мл CPC (концентрация белка 32-42 мг/мл) . 50 о Все операции проводят при 0-4 С. Выход активности лизосомальных ферментов в объединенной митохондриальной (митохондриально-лизосомаль- 55 ной) фракции 62,0-84,5 при содержаНии белка 31,? . от содержания в гомогенате печени, Содержание активности лизосомальных ферментов в митохондриально-лизосомальной фракции (М4л) приведено в табл.1. Относительная удельная активность лизосомальных ферментов находится в пределах от 1,93 для кислой фосфатазы до 7. 23 для катепсина D. Пример 2. Дигитонин растворяют в диметилсульфоксиде и разводят СРС до концентрации 4 мМ. Суспензию органелл митохондриально-лизосомальной фракции смешивают в соотношении 1; 1 с раствором дигитонина О, 8 мМ и выдерживают во льду в течение 30 мин. Затем смесь центрифугируют (18000 g, 15 мин). Надосадок, представляющий прозрачную желтоватую жидкость, используют в дальнейшем как экстракт лизосом. Установлено, что растворитель диметилсульфоксид не вызывает повреждения лизосомальиой мембраны. Действие различных. концентраций дигитонина в изотоничных растворах сахарозы на солюбилизацию лиэосомальHblx ферментов представлено на фиг.1. До концентрации дигитонина 0,1 мМ (включительно) заметного освобождения ферментов лизосом не происходит (фиг.1, график 1 — белок, 2 — кислая фосфатаза, 3 — кислая РНКаэа, 4— 3 144958, -галактозидаза, 5 — катепсины В, L, Н, 6 — катепсин Р) . В интервале О, 20,4 MM дигитонина наблюдается резкий прирост солюбилизируемой активности ферментов, заканчивающийся выходом на плато. Последующее увеличениеконцентрации дигитонина до 1,6 мМ слабо отражается на приросте активности ферментов, хотя в интервале 1,6-7.,0 мМ отмечено разнонаправленное действие дигитонина на активность кислой фосфатазы и цистеиновых катепсинов (катепсинов В,. L, Н). Степень солюбилизации отдельных ферментов различна. При 0,4 мИ дигитонина полному освобождению из лиэосом подвергаются активность Р-галактоэидазы и активность цистеиновых катепсинов. В этих же условиях кислая f фосфатаза, кислая РНКаза и катепсин D солюбилиэируются на 53-60%. Выход активности лизосомальных ферментов (от их содержания в гомогенате печени) при концентрации ди- 25 гитонина 0,4 мМ от 32% для кислой РНКаэы и 38% для кислой фосфатазы до 72% для (3 -галактозидазы и 81% для цистеиновых катепсинов. При дальнейшем увеличении концентрации дигитони- 30 на заметный прирост выхода активности наблюдается только для кислой фосфатазы. Освобождение белка органелл развивается медленно до концентрации тов. Влияние дигитонина на активность лизосомальных ферментов митохондриально-лизосомальной фракции, обработанной 0,1%-ным тритоном Х-100(М9:ш), показано в табл.2. Таблица2: Активность ферментов, %. от контроля Концентрация дйгитонина, мМ Цистеино- Катепсин вые катеп- D сины Р-галактозидаза Кислая РНКаза Кислая фосфатаза 100,4+1,4 99э 9+5 ° 9 96эО+213 0,2 100,4+2, ! 101) 1+1,8) 1 05 1 4+3 э 5 1 О 3 в 6+3 в 2 98 э 2+ 1 ь 5 1 О 1 э 5+ 1 э 6 1 04 э О» 1, 0 0 4. 103,2 2, 1 102,7+2,5 101,5+4,4 102, 1+1,4 0,8 105, 5+1, 5 50 ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, в качестве исходного сырья используют грубоочищенный 55 препарат митохондриально-лизосомальчой субклеточной фракции, гомогената печени, а в качестве экстрагирующего агента применяют дигитонин с концентрацией 0,3-0,4 мМ. Формула изобретения Способ экстракции лизосомальных ферментов, включающий выделение фракции лизосом из исходного сырья методом дифференциального центрифугирования с последующим разрушением мембран лизосом и получением фракции матрикса органелл с использованием экстрагирующего агента, о т л и ч ао 4 дигитонина 0,8 мМ (фиг.1, график 1), и далее заметно возрастает. В соответствии с данными по солюбилизации ферментов относительная удельная активность (ОУА) ферментов лизосом резко возрастает при 0,2 мИ дигитонина и достигает максимальных значений при 0,4 мИ (фиг.2, график 1 — кислая фосфагаза, 2 — кислая РНКаза, 3 — P-галактозидаза, 4 — катепсины В, L, Н, 5 - катепсин D). Наибольшие значения ОУА получены для цистеиновых катепсинов (30,7) и P— галактозидазы (24,9), а наименьшие— для частично мембраносвязанных ферментов — кислой РНКазы (12,1) и кислой фосфатазы (14, 1) . При концентрации дигитонина 0,8 мМ и выше наблюдается резкое снижение ОУА лизосомальных ферментов экстракта органелл в реа \ зультате заметного прироста солюбилизации белка, что особенно отчетливо отражается на ОУА /3-галактозидазы и катепсинов. дигитонин не оказывает действия на активность лизосойальных фермен1449580 а 1О 26 О 1Î 2 Составитель Н.Ходарав Редактор И.Горная ° Техред Л.Сердюкова Корректор Э.Лончакова Заказ 6934/28 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, r, Ужгород, ул. Проектная, 4 Ю Ю ь Ч Щ о ф Ь 3иаааакин(иР ® йигиааний < мЯ 6 1,0 gg 0 1,О gg Йим. ВОЙКОВ (жФ) Йиш пОимй (ий РО 5 Я а 8 ф о Р 10 ГР ймиаоиин (ж ф AQ8. Я
