Способ определения задерживающей способности фильтров тонкой очистки

 

Изобретение относится к способам испытаний при работе с микроорганизмами , а более конкретно к способам оценки задерживающей способности фильтров тонкой бчистки воздуха, и может быть использовано в медицинской и микробиологической промьгашенности. Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени определения . Способ заключается в:том, что бактериальные клетки прижизненно окрацивают в суспензии путем введения флуоресцентного красителя с низким квантовым выходом собственной флуоресценции в растворе, преимущественно аурамина, в концентрации 0,005-0,01%, затем инактивируют и фиксируют в них краситель в 0,8- t,0%-HOM растворе формалина в теч ение 10-12 ч, а определение концентрации тест-аэрозоля проводят путем подсчета отдельньк клеток. Для автоматизации подсчета клеток в пробе используют сканирующий микрофлуориметр в режиме регистрации сигналов от отдельных клеток. 2 табл. с fS (Л (и со СП 00 о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

nPN ГКНТ СССР (21) 419895.1/28-13 (22) 08.12.86 (46) 07.01.89. Бюл. Р 1 (71) Всесоюзный научно-исследователь-! ский институт биологического приборостроения (72) К.Н.Брюсов, С.А.Джарылгасов, Л.С.Джиндоян, И.Г.Корнеева, О.А.Крашенинников, С.И.Неуструев, Ю.В.Павлов и А.В.Тютюнников (53) 615.478.1 (088.8) (56) Матвеев В.Е. Научные основы микробиологической технологии.-М., 1985.

Можина Г,Л. и др. Методы испытаний фильтрующих материалов бактериальным аэрозолем.- Химико-фармацевтический журнал, 1972, и 6, с.23-29. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАДЕРЖИВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ФИЛЬТРОВ ТОНКОЙ

ОЧИСТКИ (57) Изобретение относится к способам испытаний при работе с микроор„„SU„„1449586 А 1 ганизмами, а более конкретно к способам оценки задерживающей способности фильтров тонкой бчистки воздуха, и может быть использовано в медицин- ской и микробиологической промышленности. Цель изобретения — повьппение точности и сокращение времени определения. Способ заключается в том, что бактериальные клетки прижизненно окрашивают в суспеизии путем введения флуоресцентного красителя с низ" ким квантовым выходом собственной флуоресценции в растворе, преимущественно аурамина, в концентрации

0,005-0,01%, затем инактивируют и фиксируют в них краситель s 0,81,0%-ном растворе формалина в течение 10-12 ч, а определение концентрации тест-аэрозоля проводят путем подсчета отдельных клеток. Для автоматизации подсчета клеток в пробе используют сканирующий микрофлуориметр в режиме. регистрации сигналов от отдельных клеток. 2 табл.

1449586

Изобретение относится к способам исп <таний при работе с микроорганизма <, а конкретно к способам .оценки задерживающей способности фильтров то кой очистки воздуха, и может быть ис<1ользовано в медицинской и микроби< логической промьппленности.

Цель изобретения — повышение точности способа и сокращение времени определения.

Способ заключается в том, что суспе зию клеток метят флуоресцирующим кр сителем с низким квантовым входом фл оресценции в растворе, преимущест" 15 ве но аурамином. При оценке фильтров ан лизируют только те чаетицы, которы содержат клетки, что позволяет

oz(нить задерживающую способность фи ьтра именно по клеткам.

2О

Введение флуоресцирующего красит я в клетки, инактивацию клеток и иксацию в них красителя проводят в успензии, что позволяет достичь . вы окой дисперсности материала, пре- 2 до вращает агрегацию клеток в конгл мераты. .1то обеспечивает генерирова е тест-аэрозоля, состоящего из ед ничных клеток, с помощью простых высокопроизводительных распь<лителей.

Та им образом, удается. достичь вь<соко < дисперсности и концентрации тэйт-аэрозоля, требующихся цля ко-ли ественной оценки фильтров тонкой оч стки (ФТО), установленных в систем очистки воздуха большой произво35 д тельности е

Подсчет. в пробах до и . после фильтра отдельных флуоресцирующих клеток позволяет получить данные по

4О проницаемости через фильтр аэрозоля, близкого к монодисперсному, в силу и 1ентичности размеров. большинства кг еток бактериальной культуры.

Колич:ественные данные, полученные

45 п<р монодисперсном или близкому к м<Пнодисперсному аэрозолю, имеют по сравнению с данными по полидисперснф <у аэрозолю более высокую точность, так как не зависят от производительности систем, в которых установлены

5О о 1ениваемые фильтры, температуры и в.Г<ажности,воздуха, эффективности пробоотборников и т.д. С другой сторонь< повьппение точности предлагаемого способа по сравнению со способом .оценки ФТО по тест-аэрозолю живых бак. териальных клеток обеспечивают тем, что при анализе подсчитывают все кл ткн, сг лер t«<па<< <.л л те -T-aэроэоле, а ре только жизнеспособные, конпенграция которых резко убывает после распыления.

В предлагаемом способе с целью получения тест-аэрозоля для испытаний бактериальные клетки прижизненно окрашивают в суспензин, а затем ннактнвируют. Условия инактивации обеспечивают фиксацию красителя для его длительного и прочного удерживания в клетке. В. результате получается материал, частицы которого при длительном хранении и распылении в аэрозоль сохраняют основные функциональ-. ные свойства: физический. размер, интенсивную флуоресценцию и высокую степень дисперсности.

В табл.1 представлены сравнительные характеристики способов оценки задерживающей способности ФТО по тест-аэроэолю живых бакт риальных клеток (известный) и тест-аэрозолю фиксированных флуоресцирующих клеток.

Из табл.1 видно, что предлагаемый способ оценки фильтров значительно быстрее и обладает большей точностью.

При разработке предлагаемого способа для получения тест-аэрозоля апробирована суспензия бактериальной культуры F,coli - штамм N-11, полученная из коллекции ГИСК им. Л.А,Тарасевича, с размером клеток 1Ä0 на

1,8 мкм, приготовленная в тех же условиях, что и суспензия клеток куль" туры S.marcescens. Клетки E,coli имеют такую п<е яркую флуоресценцию, что позволяет надежно просчитывать их в аэрозольных пробах как визуально, так и с помощью сканирующего микрофлуориметра по методике, описанной для клеток S.marcescens.

Единственное различие, выявленное при проведении сравнительных . испытаний на одном и том же ФТО, состоит в том, что Кп -. для клеток

Е.coli в 2,6 раза меньше, чем для клеток S.marcescens, что объясняется их более крупными размерами и не имеет принципиального значения.

Пример, Материал для тестаэрозоля готовят из смыва с плотной питательной среды суточной культуры

Serraria marcescens (размер клеток

О,б на 1,2 мкм) с конценграцией не менее (3-4) 10 клеток/мл. К суспен1449586

10

55 зии клеток добавляют раствор красителя аурамина до конечной концентрации 0,0087. и выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин.

При этом происходит прижизненная окраска белков цитоплазмы.бактериальных клеток. Применяемая концентрация красителя является минимальной, обеспечивающей яркую флуоресценцию отдельных клеток, необходимую для их визуального контроля, и требуемое соотношение сигнал/фон для регистрации клеток с помощью микрофлуориметра. Более низкая концентрация красителя в растворе или более короткое время окрашивания ведут к снижению соотношения сигнал/фон и к невозможности регистрировать сигналы флуоресценции от отдельных клеток, Отношение сигнала регистрации флуоресценции от отдельной клетки к сигналу от фона подложки в зависимости от концентрации аурамина в суспензии и времени окрашивания приведено в табл. 2.

Более высокие концентрации красителя и увеличение времени окраши.дания не дают существенного увеличения соотношения сигнал/фон (только увеличивают время приготовления и стоимость индикаторного материала).

На второй стадии приготовления индикаторного материала к суспензии клеток добавляют раствор формальдегида до конечной концентрации 1»ОХ и выдерживают при комнатной температуре 12 ч, Такая обработка обеспечивает практически полную инактивацию суспензии, способствует образованию дополнительных связей белков клеток с молекулами красителя и прочному удержанию его в клетке при последующем разбавлении суспензии.

Увеличение концентрации формальдегида позволяет уменьшить время выдержки, но приводит к образованию конгломератов клеток, что снижает степень дисперсности клеточной суспензии и.соответственно ее качество как индикаторного материала.

При более коротком времени выдержки суспензии с формалином (4 ч) не наблюдается полнойинактивации суспензия бактерий: при посеве О, 1 мп суспензии на чашку прорастает 3-10 бактеркальных колоний, После обработки формалином суспензию клеток можно хранить в течение 1 года °

Перед использованием индикаторный материал разводят дистиллирован. ной водой в соотношении .{1:3)-(1:4)

Готовую су-.пензию, содержащую

5 10 — t 1 клеток/ип, распыпяют ч <î с помощью пневматической форсунки

L на расстоянии 8-10 диаметров газохода до испытуемого фильтра. Расход клеточной суспензии составляет для фильтров ФТО-60 и ФТО-500 (2-5) мп/мин, для фильтров ФТО"750 и ФТО-1000 1530 мл/мин.

Отбор проб производят на щелевой импактор с номинальной объемной ско ростью 50 л/мин и отсечкой (Ц о), 20 рВВНоН 0,7 мкм (размер сОпла

0,45 ° 30 мм). До фильтра отбор проФ. выполняют с использованием дозатора аэрозоля с объемной скоростью подачь пробы 0,1 - 0,2 л/мин.в течение

25 10-20 с, после фильтра в импактор с номинальной объемной. скоростью в течение 10-20 мин. В качестве под ложки применяют предметное стекло, покрытое слоем вазелина, Пробу аэро золя осаждают на стекле в виде полоски размером 0 5 30 мм.

Предметное стекло с пробой поме1щают под флуоресцентный микроскоп с увеличением 900<1200 с возбуждающими интерференционными фильтрами на

436 нм и СС15, светоделительной пластиной на 460 нм и запирающими фильтрами ЖС 11 и Ж 17 и подсчитывают количество отдельных флуоресцирующих

40 клеток в нескольких полях зРения в различных участках аэрозольного рсадка. В пробах до фильтра (количество клеток в поле зрения 500-100) подсчитывают клетки в 10-12 полях зре45 HHJI В пробах после фильтра с коэффициентом проницаемости около 1<10 Й количество клеток в аэроэольном осадке колеблется от 2 — 3 клеток в поле зрения до 1 клетки в 10 полях зрения, и подсчет производится в 30-50 полях зрения.

Коэффициент проницаемости фильтра

{К„ ) определяется по формуле

- - — . 100X, N .V<

< <» 1 1 где N, — среднее количество в поле зрения микроскопа в пробе до фильтра;

1449586

Таблица

Способ

Показатель точносСреднее значение, 1 „р

Ошибка

Время, необходимое для оценки фильтра ч

Тип испы среднего

m —

Х туемого фильтра ти, С, Ж

25 0,52 10 0,16 IO 31

Известный ФТО-60

Предлагае" мый

0,7 1,14 1О 0,25 10 18

0,58 10 22

1,6.10

Известный ФТО-750

Предлагаемый

0,32 10 9

0,7 3,7 "10

И вЂ” среднее количество н поле зрения микроскопа в пробе после фильтра;, V< - объемы пробы до фильтра,л;

V — объем пробы после фильт1 ра, л., Предлагаемый способ позволяет опре елить коэффициент проницаемости, фи ьтра до 1 10 % и больше. Для се ийно выпускаемых фильтров ФТО-60, ФТ вЂ . 500, ФТО-750, ФТО-1000 коэффициен проницаемости, определенный по пр эдлагаемому способу, колеблется от 5 10 до 5.10 %.

Для автоматизации анализа проб ис ольэуют макетный образец микрофл ориметра, выполненный на базе микро копа Виолам-211 с осветителем

ОИ 18А и фотометрической насадкой

Ф Л-1а. Микрофлуориметр укомплекто" ва сканирующим предметным столиком и кропрбцессорным блоком управлени, обеспечивающим сканирование пр б в двух направлениях по програм" ме и накапливающим данные по сигна! лам флуоресценции от отдельных клеток.

Регистрацию сигналов флуоресценцн и от отдельных клеток осуществля". ют в полосе сканирования измерительнс го зонда диаметром 5 мкм. За изме" р тельный цикл длительностью 20 с с анируется площадь, эквивалентная п ощади восьми полей зрений.

Подсчет клеток в пробе с помощью

1с анирующего микрофлуориметра прои водят в 3 — 4 участках по всей дфине аэроэольного осадка.

Предлагаемый тест-аэрозоль может быть использован в качестве трассера в исследованиях и испытаниях, связанных с охраной окружающей среды от гаэовоздушных загрязнений.

Предлагаемый способ исключает ошибки в оценке задерживающей спо-. собности фильтра и обеспечивает более точный расчет вредности газовоздушных выбросов из технологических линий микробиологического синтеза.

Это позволяет повысить эффективность мероприятий по улучшению условий

1Б труда и обеспечению охраны окружающей среды.

Формула и з обретения

Способ определения задерживающей

2р способности фильтров тонкой очистки, предусматривающий распыленче суспензии бактериальных клеток тест-аэрозоля в воздушном потоке, направленном на фильтр, отбор проб тест-аэро"

25 золя до и после фильтра и оценку результатов тест-аэрозоля в пробах, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и сокращения времени определения, бакgp териальные клетки тест-аэрозоля прижизненно окрашивают в суспензии аурамином в концентрации 0,005 "

0,01 мас.% и выдерживаются в течение 15 — 20 мин, затем инактивируют .„ и фиксируют краситель в течение

1012 ч в Ор8 lр0%-ном растворе формалина, а оценку результатов проводят путем подсчета отдельных флуоресцирующих клеток, 1449 586

Табли ца 2

45.1,2

1,3

1,2

4 3

4,0

1,9

4,6

4,5

2,2

0i02

Редактор И.Горная

Заказ 6934/28 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Концентрация аурамина,в суспензин, 7, О, 001

0,007

Отношение сигнал/фон ат отдельных клеток после окрашивания в течение времени, мин

Составитель И.Привалова

Техред Л.Серд.окова Корректор A.Îáðó÷àð