Способ определения недостаточности печени

 

Изобретение относится к медицине , касается клинической биохимии и может быть использовано в клинической и экспериментальной хирургии, трансплантологии. Цель изобретения - повьшение точности способа путем учета состояния интактных энергизованных митохондрий. Задача решается за счет объективизации оценки обмена ее митохондрий, выделенных из биопсированной ткани печени больных людей и животных. Для этого измеряют величины выхода Н ионов в суспензию митохондрий (индуцированного дробными добавками СаС по 25 мкК до полного насыщения ими спонтанного выброса из митохондрий) с помощью поочередного внесения в инкубационную смесь с заранее добавленным сукцинатом АДФ и глутамата и последующим определением отношения уровня накопленного в митохондриях кальция в присутствии сукцината после фосфорилирования АДФ к его уровню после влияния на окисление сукЦината глутаматом. При уменьшении значения этого отношения ниже 1,21 ед диагностируется недостаточность печени. Способ повышает точность диагностики недостаточности печени до 90,9%, обеспечивает срочность вьщачи результатов, не требует дополнительных технических средств анализа. 2 табл. сл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (59 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОЬЮ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4061101/28-14 (22) 22.04.86 .(46) 30.01 ° 89. Бюл. 9 4 (71) Ереванский филиал Всесоюзного научного центра хирургии АМН СССР (72) И.P.Саакян, Т.Д.Карапетян, Л.Ф.Шердукалова и А.Г.Пилоян (53) 612.015 (088.8) (56) Тезисы 11 научной конференции. Ереван, 1981, с.182-184. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПЕЧЕНИ (57) Изобретение относится к медицине, касается клинической биохимии и может быть использовано в клинической и экспериментальной хирургии, трансплантологии. Цель изобретения— повышение точности способа путем учета состояния интактных энергизованных митохондрий. Задача решается за счет объективизации оценки Н /Са + обмена ее митохондрий, вьщеленных из биопси4 1

Изобретение относится к медицине, а именно клинической биохимии, и может быть использовано в клинической и экспериментальной хирургии, трансплантологиии.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет учета состояния интактных энергизованных митохондрий.

Цель достигается путем измерения величины выхода Н ионов в суспензию митохондрий, индуцированного дробными добавками СаС1 по 25 мИ1 до сос„.80„, 1455305 А1 рованной ткани печени больных людей и животных. Для этого измеряют величины выхода Н ионов в суспензию митохондрий (индуцированного дробными добавками СаС1 по 25 Mrs, до полного насыщения ими спонтанного выброса иэ митохондрий) с помощью поочередного внесения в инкубационную смесь с заранее добавленным сукцинатом АДФ и глутамата и последующим определением отношения уровня накопленного в митохондриях кальция в присутствии сукцината после фосфорилирования АДФ к его уровню после влияния на окисление сукцината глутаматом. При уменьшении значения этого отношения

Щ ниже 1,21 ед диагностируется недостаточность печени. Способ повышает точность диагностики недостаточности печени до 90,9Х, обеспечивает сроч- С, ность выдачи результатов, не требует дополнительных технических средств анализа. 2 табл.

2 тояния насыщения им, и спонтанного выброса иэ мнтохондрий с помощью IIQ очередного внесения B инкубационную смесь с заранее добавленным сукцина5 том АДФ и глутамата. Дале е определяется их отношение, отражающее степень роста накопленного в митохондриях кальция в присутствии сукцината после фосфорилирования АДФ относительно

1 его уровня после влияния на окисление сукцината углутаматом.

После добавления АДФ и синтеза АТФ в присутствии сукцината слособность

3 145530 митохондрий к накоплению кальция увеличивается. Глутамат действует на способность митохондрий к накоплению кальция, изменяя интенсивность окисления сукцината(избирательно регулирует активность специфического фермента окисления сукцината). Это действие глутамата проявляется при патологии и отсутствует в норме.

Изменения способности митохондрий к накоплению кальция нод действием

АДФ и глутамата наиболее четко отражаются их отношением. При уменьшении значения этого отношения ниже 1,21 диагностируется недостаточность печейи.

Способ осуществляется следующим образом.

Крыс линии Вистар после подсадки

20 им сердца от крыс линии Август в гетеротопическую позицию через 212 сут забивают под эфирным наркозом. Крыс линии Август после введе ния им взвеси димфоцитов крови (10

6 клеток в объеме 0,1 мл) от крыс ли1 нии Вистар с заранее подсаженным им сердцем от крыс линии Август забивают через 3-7 сут под эфирным наркозом и быстро извлекают печень, из которой

30 выделяют митохондрии общепринятым методом.

У больных,во время полостных операций по поводу резекции язвы 12перстной кишки или рака желудка. биопсируют ткань печени, Из биоптата вы- 35 деляют. митохондрии общепринятым методом.

Инкубацию митохондрий и регистрацию величины закисления суспензии . митохондрий при выходе Н ионов под

4действием СаС1 (добавляя дробно по

25 мкИ до состояния полного насыщения и последующего обратного выхода его) производят. в двух .пробах . 1. проба : в инкубационную смесь последова- 45 тельно вводят сукцинат 9 мИ, глутамат 2 MN митохондрии, а затем

СаС1, 2 проба: послед вательно ввоФ дят сукцинат 9 мИ, АДФ 200 мкМ, выжидают, пока из АДФ синтезируется 50

АТФ, а затем вносят СаС1

Измеряют величину выхода Н ионов в суспензию митохондрий в каждой из указанных смесей, т.е. после очередного добавления АДФ, который синтезируется в АХФ, и глутамата, и определяют отношение этих величин.

Оно отражает степень роста накопленного в митохондриях кальция в присутствии сукцината (С) после фосфорилирования АДФ относительно его уровня после воздействия на окисление сукцината глутаматом (Гл)

g(H j С+АДФ а (Н ) С+Гл

Время с момента выделения митохондрий, в течение которого выдается результат анализа, составляет в среднем 20-25 мин, Для расчета укаэанного отношения нет необходимости измерять содержание митохондриального белка, При значениях 1,21 и ниже диагностируется недостаточность печени.

Пример 1. Крыса забита на

5-е сутки ° Изъята печень, выделены митохондрии и измерен выход Н+ ионов под воздействием СаС1 в присутствии

С+АДФ и С+Гл и С:

Ь (H+) С+АДФ вЂ” — — — — — =0,5 ед;

Д(Н ) С+Гл

h(H ) С+Гл

1,45 ед (прототип), 5(Н) С

Диагностирована недостаточность печени.

Пример 2 ° Крыса забита на

2-е сутки, Изъята печень, выделены митохондрии и измерен выход Н ионов под воздействием СаС1 в присутствии

С+АДФ, С+Гл и С:

6(Н ) С+АДФ

1 195 ед ь д °

5(H ) С+Гл (Н ) С + Гл — — «+ — — — — -1,03 ед (прототип)

6(Н 3 С

Диагностирована недостаточность печени.

Пример 3, Крыса забита на

2-е сутки. Изъята печень, выделены митохондрии и измерен выход Н" ионов под воэдействием СаС1, в присутствии

С+АДФ, С+Гл и С:

А(Н ) С+АДФ

1 48 ед у дt

5(H ) С+Гл

h)H ) С+Гл

0,85 ед (прототип), $(H )С

1455305

Диагноз не установлен ни по предлагаемому способу, ни по прототипу.

Он также не установлен по параметрам дыхания митохондрий (полярографический анализ).

Пример 4. Крыса забита на

3-е сутки, Изъята печень, выделены митохондрии и измерен выход Н ионов под воздействием СаС1 в присутствии

С+АДФ, С+Гл и С:

Д(Н j С+АДФ вЂ” — -- — --- = 0,53 ед;

h (Н ) С+Гл

Д(Н ) С+Гл

= О, 81 ед (прототип) .

Д(Нj С

Диагностирована недостаточность печени. .Пример 5, Крыса забита на 5-е 20 сутки. Изъята печень, выделены митохондрии и измерен выход Н ионов под воздействием СаС1 в присутствии

С+АДФ, С+Гл и С:

Д(Н ) С+АДФ

= 0,79 ед д

Д(Н ) С+Гл

g (Н ) С+Гл

= 0,86 ед (прототип), Д(Н1

Диагностирована недостаточность печени.

Пример 6, Крыса забита на 3-е сутки. Изъята печень, выделены митохондрии и измерен выход Н ионов под воздействием СаС1 в присутствии

С+АДФ, С+Гл и С:

Д(Н ) С+Гл

Диагностирована недостаточность печени.

Пример 8. Больная Д., 41 год.

При клиническом и специальном обследовании поставлен диагноз язвенной деформации луковицы 12-перстной кишки. Проведена биопсия печени. Выделены митохондрии и измерен выход Н ионов под воздействием СаС1 .

g(H $ С+АДФ

--- — — — — — = 0 85 ед в

Д(Н 1 С+Гл

g (H+) С+Гл

g (Н 1 С

2,937 ед.

25 Пример 9. Больная.Д., 70 лет.

Гри клиническом и специальном обследовании поставлен диагноз: рак желудка. Проведена биопсия печени. Выделены митохондрии из биоптата и измерен выход Н ионов под воздействием СаС1

Д(Н 1 С+АДФ вЂ” 0,646 ед;

Диагностирована недостаточность

40 печени.

Предлагаемым способом обследовано

57 крыс. Результаты анализа приведены в табл.1 и 2.

Точность диагноза недостаточности

45 печени у обследованных животных по предлагаемому способу при пересадке сердца и пересадке ли" ôîöèòîâ составляла соответственно 90,4 и 91,7Х, в то время как точность диагноза по известному способу — 66,6 и 58,33, Предлагаемый способ позволяет диагностировать недостаточность печени у всех обследованных больных.

g (Н 1 С+АДФ вЂ” 1 О

Э

Д(Н ) С+Гл ед;

P (H+$ С+АДФ вЂ” — 1,21 ед, Д(Н ) С+Гл

Д(Н 3 С+Гл — = 0,83 ед (прототип).

Д(Н) С

Диагностирована недостаточность печени.

Пример 7. Больной А., 61 год, при клиническом и специальном обследовании поставлен диагноз рубцовоязвенной деформации луковицы 12перстной кишки. Проведена биопсия печени. Выделены митохондрии из биоптата и измерен выход Н ионов под воздействием СаС1

1,379 ед.

Д(H) С

Диагностирована недостаточность печени.

Д(Н ) С+Гл

Д(Н j С+ Гл

1,976 ед.

Д (Н") С ормула из о бретения

Способ определения недостаточности печени, включающий определение реакции митохондрий печени путем инкуба7 1455305 8 ции их в сРеде, соДеРжашей сукЦинат, бации, при этом в первую дополнительи РегистРации выхоДа ионов воДороДа но добавляют Д 1ф, а во вторую — глуиз митохондрий после добавления хло- тамат, регистрируют величины выхода ристого кальция, о т л и ч а ю щ и и - ионов водорода в первой и второй

5 с я тем, что, с целью повьппения средах, рассчитывают отношение первой точности способа за счет учета состо- величины к второй и при его значении яния интактных знергизованных мито- 1,21 и ниже определяют недостаточхондрий, используют две среды инку- ность печени.

Т а б л и ц а 1

Результаты анализа Н /Са + обмена митохондрий печени по способу предлагаемому прототипу

Контроль

Контроль сердца лимфоцитов сердца лимфоцитов

О,4О

0,42

О, 50"

0,53

0,80

0,85

0,81

1,22

0 83

0,835

0,88

1,26

0,57" О, 53

0,84

0,90

0,86 t 288

0,63

0,71

0,86

0,90

0,97

1,29

0i 53

0,54

0,68

0,73

0,79

1,16

0,89

1,03

1,03

О, 74"

О, 896

1,08

1,35

i,17

0,90

1,36

0,97

1,375

1,00

1,40

i 42

1,00

1, 17

1,21

1,43

1,01

1,48

1,095

1 23

1,10

1,48

1, 586

1,12

1,13

1,61

1,64

1,14

1,69

1,16

1,70

1,19

1,86

1, 19

1,48

1,92

1,30

1,34

1,39

f,42

1,43

1,45

1, 45"

1,47

1,49

1,50

1,50

1,68

1,70

1,70

1,39

1,39

1,45

1,45

2,30

3,02

3,05

0,74

0,80

0,82

0,84

0,89

0,90

0,91

0,96

0,98

f 03

1,09

1,18

1,20

Продолжение табл. 1

Результаты анализа Н /Ca обмена митохондрий печени о способу б прототипу предлагаемому

Пересадка онтроль

»»«»«»« рдца лимфоцитов оцитов

1,73

1,33

1,99

2,05

2, 135

2э 31

2,70

Отличие от контроля.

Таблица 2

Вид эксперимента

Коли- . чество жив9т ных прото" предлатипу гаемому прототипу предлагаемому

21

90,4

66,6

19

Пересадка ликфоцитов 12

91,7

Составитель А.Агуреев

Редактор Л1Пчолинская Техред М.Дидык

Корректор Г.Решетник

Заказ 7452/53 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Контроль 24

Пересадка сердца 21

1455305 !

Количество животных с правильно установленным диагнозом по способу

Точность диагноза, Е по способу