Способ определения концентрации общего тиамина

 

Изобретение относится к области биохимии, в частности к витаминологии , и может быть использовано при определении количественного содержания тиамина в биологических материалах , в витаминных препаратах, продуктах питания и кормах. Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа. Для зтого готовят стандартный образец тиамина, меченного по С , и исследуемую пробу вводят в них специфический реагент-тиаминазу 1, инкубируют при 0-4 С с образованием каталитических продуктов и последующим сопоставлением их концентраций.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PECflYS flHH

1511 4 G 01 И 33/15

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4073621/30-13 (22) 02.06.86 (46) 15.03.89. Бюл. 11 10 (71) Институт биохимии АН БССР (72) С.С.Пузач, З.В.Горбач и Ю,М.Островский (53) 577. 164. 1 1 (088. 8) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ . КОНЦЕНТРАЦИИ

ОБЩЕГО ТИАМИНА (57) Изобретение относится к области биохимии, в частности к витаминологии, и может быть использовано при

Изобретение относится к биохимии, в частности к витаминологии, и может быть использовано при определении количественного содержания тиамина в биологических материалах, в витаминных прег аратах, продуктах питания и кормах.

Цель изобретения — увеличение чувствительности и точности способа.

Пример 1. Инкубационную среду, содержащую 0,7 мл фосфатного буфера О, 2 М, с рН 6,0-7, 0; 0 075 мл никотинамида; 0,025 мл меченного тиамина по тиазолу (" С) и 0,1 мл анализируемой пробы, помещают в емкость со льдом и водой и охлаждают до 0-4 С.

После охлаждения среды до указанной температуры, с целью проведения ферментативной реакции в инкубационную среду вносят фермент тиаминазу I в объеме 0,1 мл, полученный из мышц пресноводных двустворчатых моллюсков

Anodonta cygnea, и проводят,инкубацию

ÄÄSUÄÄ 1465762 А1 определении количественного содержания тиамина в биологических материалах, в витаминных препаратах, продуктах питания и кормах. Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа. Для этого готовят стандартный образец тиамина, меченного по С, и исследуемую про1% бу вводят в них специфический реагент-тиаминазу 1, инкубируют при

0-4 С с образованием каталитических продуктов и последующим сопоставлением их концентраций.

2 (/) среды в течение 1 мин при 0 С. Ферментативная реакция сопровождается увеличением скорости образования продукта реакции (С1 — тиазола, который выделяется в инкубационную среду. о

Остановку реакции с одновременным ф отделением продукта реакции от мечен- ф ного субстрата — тиамина, известное р количество которого содержится в инкубационной среде, проводят путем до- ©, бавления в среду 2 мл этилацетата (соотношение объемов среды и экстрагента 1:2) и проводят интенсивное перемешивание содержимого емкости встряхиванием. При этом происходит селективное экстрагирование продукта реакции — тиаэола в этилацетатную фазу, а тиамин остается в водной фазе. Для разделения фаз проводят центрифугирование среды при

3000 об/мин в течение 5 мпн.

После разделения 0,5 мл этилацетата, содержащего тиазол, вносят в

Составитель О. Скуратовская

° Редактор Н.Касарда Техред А. Кравчук . Корректор С. И!екмар

Заказ 937/43 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

3 146 диоксановый сцинтиллятор (5 мл) для определения радиоактивности продукта реакции. Радиометрическое измерение проводят на жидкостном сцинтилляционном спектрометре. Для определения общего тиамина строят калибровочный график зависимости количественного образования тиазона при известной концентрации тиамина.

Построение калибровочной кривой, В двойной ряд пробирок, помещенных в водяную баню, разливают по 0,1 мл водного стандартного раствора нерадиоактивного тиамина, Концентрация тиамина в водном растворе в каждой пробирке составляет, мкМ: 0,15; 0,3;

0 6; 1 5; 3 0; 6,0. В одну пару пробирок (контроль) вместо стандартного раствора тиамина вносят по 0,1 мл воды. В каждую пробирку дабавляют по О,1 мл водного раствора, содержащего 2,4 мкМ (С) -тиамина, разведенного так, чтобы общее число импульсов в пробе составляло 100000 нмпульсон за 1 мин. В каждую пробир.ку приливают по 0,6 мл 0,2 М раствора натрий фосфатного буфера (рН 6,4)

Содержимое пробирок перемешивают, (В каждую пробирку вносят одинаковое количество тиаминаэы (0,0025 NE) в объеме О 2 мл. Приготовленные пробы

Э

0 ! инкубируют н течение 1 мин при 0 С, после чего останавливают реакцию.

Разделение фаз после встряхивания в течение 3 мин достигают центрифугированием при 1500 в течение 10 мин. ! 0,5 мл этилацетата, содержащего продукт реакции — тиазол, отбирают иэ всех проб для подсчета радиоактивности, Строят калибровочный график, где по оси абсцисс откладывают значения нерадиоактивного тиамина в инкубационной среде в мкИ (0;0,15;0,3...), а по оси ординат — значения отноше5762

4 ний радиоактивности продукта реакции, тиазола (С ) без разведения метки (контроль) к С„ — значению радиоакЦ тивности продукта реакции тиазола при разведении метки нерадиоактивным тиамином в инкубационной среде.

Пример 2. К 1 мл мочи вносят 50 мг активиронанного угля. Уголь

10 отделяют центрифугиронанием. Десорб-, цию тиамина с угля проводят 2 мл подкисленного метанола. Полученный экстракт нысушивают под струей воздуха. Осадок растворяют в 0,2 мл дистиллированной воды. 0,1 мл раствора используют для анализа. После проведения в инкубационной среде ферментативной реакции, амплитуду всплеска образования тиазола фикси20 руют счетчиком

° Зная значения С (контроль) и С„ находят отношение С /С„. 11олучают соответствующую этому значению точ25 ку на калибровочной кривой. Этой точке соответствует искомое значение концентрации общего тиамина в анализируемой пробе на оси абсцисс.

З0Формула изобретения

Способ определения концентрации общего тиамина, предусматривающий приготовление стандартного образца .и исследуемой пробы, введение в них специфического, реагента, инкубирование с образованием каталитических продуктов и последующим сопоставлением их концентраций, о т л и ч а ю40 шийся тем что с целью увелиt Э чения точности и чувствительности, в качестве стандартного образца ис14 пользуют тиамин, меченный по С и .специфический реагент-тиаминаэу 1, при этом инкубацию осуществляют при

45 0-4 С