Колонка для жидкостной хроматографии и способ ее заполнения

 

Изобретение относится к аналитическому приборостроению и может быть использовано в химической, медицинской, биологической и других отраслях промышленности для анализа сложных смесей веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Цель изобретения - повышение скорости хроматографирования, разрешающей способности колонки и обеспечение прямого анализа сыворотки и других компонентов крови. Колонка заполнена полностью пористым гидрофильным гелем, в состав которого входят фрагменты винилового спирта. Гель имеет средневесовой диаметр гранул от 4 до 20 мкм, величину влагоудерживания от 0,6 до 2,0 мл/г и концентрацию гидроксильных групп от 3 до 15 мэкв/г. Гельный слой имеет степень однородности от 2,0 до 4,0 определяемую через отношение ВЭП к средневесовому диаметру гранул и упаковочное отношение от 0,66 до 0,78, определяемое по формуле 1 - VOVT,где VO означает объем воды с наружной стороны гранул,VT -общий объем колонки. Колонку заполняют путем продвижения гельной суспензии потоком жидкости. Поток жидкости в объеме от 1 до 300 внутренних объемов колонки с постоянной скоростью 0,2-1,5 м/ч. Затем скорость потока увеличивают с обеспечением среднего увеличения давления от 2 до 80 кг/см<SP POS="POST">2</SP>/ ч и максимального давления до 60 кг/см<SP POS="POST">2</SP>/мин. 6 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

58 А (19) (П) (511 4 G 0 l N 30/06

ВСЕСОЮЗНАЯ

ПАТЕ1ТИО- ТЕХНКЧЕСКАя

Г.: ;БЛ1ЮТ1=КД

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ Гкнт СССР (21) 3393025/24-25 (22) 11.02.82 (31) 56-17985 (32) 12,02 ° 81 (33) JP (46) 07. 04. 89. Бюп.. ¹ 13 (71) Асахи Касеи Когио Кабусики

Кайся (JP) (72) Кохдзи Ногути и Масао Касаи (JP) (53) 544.543(088.8) (56) Патент Великобритании

В 2061954, кл. G О1 N 31/08, 1986,:

Патент Японии № 54-64657, кл. G 01 N 31/08, 1981.

Hiroyuki Hotaron и др. Эксперимен тальная высокоэффективная жидкостная хроматография, Кагаку Дожин, Япония, 1977. (54) КОЛОНКА ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И СПОСОБ ЕЕ ЗАПОЛНЕНИЯ (57) Изобретение относится к аналитическому приборостроению и может быть использовано в химической, медицинской, биологической и других отраслях промьппленности для анализ а сложных смесей веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Цель изобретения — повьппение

Изобретение относится к области аналитического приборостроения и может быть использовано в химической, медицинской, биологической и других отраслях промьппленности для анализа скорости хроматографирования, разрешающей способности колонки и обеспечение прямого анализ а сыворотки и других компонентов крови. Колонка заполнена полностью пористым гидрофипьным гелем, в состав которого входят фрагменты винилового спирта. Гель имеет ср едневесо вой диаметр гр анул от

4 до 20 мкм, величину влагоудержива.ния от 0,6 до 2,0 мп/г и концентрацию гидроксильных групп от 3 до

15 мэкв/г. Гельный слой имеет степень однородности от 2,0 до 4,0, определяемую через отношение ВЭП к средневесовому диаметру гранул и упаковочное отношение от 0,66 до 0,78, определяемое по формуле I — V /V где V означает объем воды с наружо ной стороны гранул, V< — общий объем колонки, Колонку з аполняют путем продвижения гельной суспензии потоком жидкости. Поток жидкости в объеме от

1 до 300 внутренних объемов колонки .с по сто янной скор о ст ью О, 2- 1, 5 м/ч.

Затем скорость потока увеличивают с обеспечением среднего увеличения давления от 2 до 80 кг/см /ч и максиг мального давления до 60 кг/см /мин.

2 с. и 7 з.п. ф-лы, 5 ип, f сложных смесей веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Цель изобретения — повышение скорости хроматографирования, разреша1471958 ющей способности колонки и обеспечение прямого анализа сыворотки и других компонентов крови.

На фиг. 1 показан график, иплюст5 рирующий определение объема элюированного пика (V ) и ширины пика (W) для последующего расчета эквивалентной высоты теоретической r арелки колонки; на фиг. 2 — хроматограмма раз- 10 деления коммерческой смеси тироглобулина, альбумина, миоглобина и фенилаланина; на фиг. 3 — хромато грамма разделения нормальной человеческой . сыворотки; на фиг. 4 — хромато- f 5 грамма разделеиия человеческой сыворотки при почечном нарушении; на фиг. 5 — хромато грамма разделения человеческой сыворотки при различных скоростях потока элюента. 20

Хроматографическая колонка содержит корпус диаметром 4-50 мм и длиной

100-600 мм, заполненный слоем полностью пористого гидрофильного геля, в состав которого входят фрагменты винилового спирта, Гель имеет средневесовой диаметр гранул 4-20 мм, величину влагоудерживания 0,6-2,0 мп/г и концентрацию гидроксильных групп

3-15 мэк/г.

Гельный слой имеет степень однородности 2,0-4,0, которая определяется через отношение ЭВТТ/Др, где

ЭВТТ означает эквивалентную высоту 35 теоретической тарелки предлагаемой колонки, а Д вЂ” средневесовой диаметр гранул. Упаковочное отношение слоя

0,66-0,78 и определяется по формуле о 40 где V — объем воды с наружной стороны гранул; V — общий объем колонки. Заполнение колонки осуществляется следующим образом, Готовится гельная суспензия, содержащая 1,4- 45

4,0-кратное количество геля, которое необходимо дпя заполнения колонки.

Суспензию подают в загрузочную аппаратуру с последующей ее герметизацией. Аппаратуру подсоединяют к колонке, на концах которой установлены фитинги с фильтрами. Заполнение колонки суспензией осуществляют потоко м жидко сти, который подают с постоянной скоростью 0 2-1 5 м/ч в

Э Э

55 объеме 1-300 внутренних объемов колонки. Затем скорость потока увеличивают, обеспечивая среднее увеличение г давления от 2 до 80 кг/см /ч и максимапьное увеличение давления до

60 кг/см /мин.

После заполнения отсоединяют колонку от загрузочной аппаратуры и фиксируют гельный слой фитингом с фильтром на верхнем конце колонки.

Пример 1. Подвергают суспензионной полимеризации смесь 80 г дивиниладипата (имеющего чистоту более

99ь), 200 r н-бутилацетата, 6,4 r поливинилацетата. (имеющего степень

I полимеризации 500) и 1 г 2 2 -азобисо изобутиронитрила при 70 С в течение

20 ч в 1,2 л воды, содержащей

1 мас.Х поливинилового спирта как стабилизатора суспензии для получения полидивинил адипат а. После з аверш ения полимериз ации образовавшиеся гранулы выделяют фильтрованием, промывают водой, затем метанолом и сушат. Загружают гранулы в круглодонную колбу емкостью 2 л вместе с 1 л метанола, содержащего 32 г гидроокиси натрия, смесь нагревают при перемешивании при 40 С в течение 24 ч. После завершения реакции отфильтровывают полученные гранулы и промывают их метанолом, а затем ацетоном. . Полученные таким образом гранулы поливинилового спирта загружают в круглодонную колбу вместе с жидкой смесью, содержащей 350 м диметилсульфоксида, 350 мп ацетона, 37 r эпихлоргидрина и 16 г гидроокиси натрия, смесь нагревают при перемешивао нии при 50 С в течение 24 ч. После завершения реакции гранулы отфильтровывают и последовательно промывают горячей водой, а затем ацетоном. Повторяют еще раз операции фильтрования, промывки и реакцию аналогично описанному по такой же методике.

Полученные гранулы нагревают при о

80 С в течение 24 ч при перемешивании вместе с 1 н. водным р аст вором гидроокиси натрия, после чего гранулы тщательно промывают водой.

Определяют средний диаметр полученных таким образом гранул, используя ".Сои1 ег Counter Model ZB" (торговое название прибора, производимого и выпускаемого Каултер Электроникс Инк., США) . Средний диаметр гранул 12,3 рм, а величина W„1,75 мл/г.

Часть полученного геля вводят в реакцию с уксусным ангидридом при о

90 С в пиридиновом растворителе и при расчете концентрации гидроксиль1958

5 147 ных групп (q„,) в геле из количества прореагировавшеro уксусного ангидрида находят, что величина 1 равна

9, 1 мэк/г.

Погружают 10 r (сухой вес) полученных таким образом гранул на всю ночь в 100 мл дистиллированной воды для набухания. Монтируют первый концевой фиттинг, снабженный фильтром с диаметром пор 5 р м, на одном конце колонки с внутренним диаметром

7,5 мм и 500 мм длины, а другой открытый конец колонки соединяют с загрузочным устройством с внутренним объемом 100 мп. Загрузочное устройство снабжено в его верхней части загрузочным отверстием дпя пасты геля и загрузочным отверстием для жидкости для заполнения, которое связано с загружающим насосом патрубком из нержавеющей стали, и манометром. 3 агруз очное устрой ство может быть герметизировано после заливки в него пасты геля. Упомянутую пасту геля тщательно диспергируют в течение

10 мин с помощью ультразвуковой очищающей машины (Branson В-12 тип, выпускаемой и продаваемой Брансон Кпининг Эквипмент Компани, CIIIA) и выливают в загрузочное устройство через загрузочное отверстие для пасты ге.ля. Затем в течение 60 мин пропускают дистиллированную воду (жидкость для з аполнения) через з агруз очное устройство и колонку со скоростью потока 1,0 мп/мин (ЛС (линейная скорость): 1,36 м/ч).После этого увеличивают скорость потока дистиллированной воды при среднем увеличении давления со скоростью 20 кг/см /ч в слое геля и при максимальной скорости увеличения давления 20 кг/см /мин в слое т геля до тех пор, пока манометр не покажет 85 кг/см, Затем пропускают дистиллированную воду в течение 3 ч, выдерживая при этом давление на манометре 85 кг/см ; контролируя количество слоя дистиллированной воды с помощью насоса, После прекращения пропускания дистиллированной воды колонку отсоединяют от загрузочного устройства и присоединяют второй концевой фиттинг, имеющий такую же конструкцию, что и первый концевой фиттинг, на открытый конец колонки.

Итак, заполнение колонки з акончено, Полученная колонка имеет величину

ЭВТТ/Д 3,3, а величину V;/V, 1,54

45 и исключительный предел молекулярного веса (считая па декстран) около

2000000.

Проявляют на полученной колонке водный раствор коммерческих тироглобулина, альбумина,миоглобина и фениланина, элюируют 0,05 мол/л фосфорнокислым буфером (рН 6,7), содержащим сульфат натрия и концентрации

0,2 мол/л при скорости потока

l,0 мп/мин. Вещества могут быть разделены очень эффективно (фиг. 2), вымываясь в порядке молекулярного веса. Время анализа составляет только около 20 мин.

Пример 2 ° Загружают жидкую смесь 100 r винил ацет ат а, 32, 2 r триаллилизоцианурата (Х вЂ” число:

0,25), 100 г н-бутилацетата и 3,3 г

2,2 -азобисизобутиронитрила в цилиндрическую колбу емкостью 2 л вместе с 0,8 л воды, содержащей 1 мас.7. поливинилового спирта как стабилизатора суспензии, полученную смесь перемешивают до образования стабильной суспензии. Затем суспензию нагревают при 65 С в течение 18 ч, а затем о при 75 С в течение 5 ч при перемешивании для проведения суспензионной полимеризации. После завершения полимериз ации отфильтровывают образовавшиесяя гранулы, промывают их водой, а затем метанолом и сушат. Гранулы загружают в круглодонную колбу емкостью 3 л вместе с 2 л метанола, содержащего 47 г гидроокиси натрия, полученную смесь нагревают при перемешивании при 15 С в течение 20 ч для осуществления реакции переэтерификации. После этого проводят седиментационную классификацию в воде, получают гели (11, 9,8 мм, Д /Дя 1,28)

Полученные гели имеют концейтрацию гидроксильных групп 7,3 мэк/г и величину 11 1,58 мп/г.

Затем отвешивают из геля три порции по 7 r (сухой вес). Каждую из трех порций погружают на ночь в 100мл

0,2 мол/л водного раствора сульфата натрия и диспергируют в течение

5 MHH с помощью ультразвукового гомогенизатора (тип US-ЗОО, производи1ьй и продаваем и Ниппон Сейки Сейсакупо К. К,, Япония) . Каждую из полученных паст гелей выливают в загрузочное устройство, ко ..oone присоединено к форколонке с внутренним диа1471958

М

Колон- ЭВТТ; /Ч Pd ка

1,34

1,61

1,90

2,95

2,30

3,34

0,67

0,71

0,74 метрбм 7,5 мм и длиной 100 мм, соединенной одним концом с основной колонкой из нержавеющей стали с внутренним диаметром 7,5 мм и длиной

250 мм, имеющей на другом конце первый концевой фиттинг, снабженный фильтром, как использовано в примере 1, форколонка и основная колонка заполнены водным 0,2 мол/л раствором суль- 10 фата натрия. После герметизации загрузочного устройства пропускают водный 0,2 мол/л раствор сульфата натрия (жидкости для з аполнения) через загрузочное устройство и форколонку 15 и основную колонку при скорости потока 0,5 мп/мин (ЛС 0,68 м/ч) в течение 60 мин с помощью насоса. В течение этого времени паста геля движется в основную колонку, в то время 20 как водный 0,2 мол/л раствор сульфата натрия выгружается, увлекая пасту геля, этот раствор используется в качестве жидкости для заполнения, через первый концевой фиттинг на нижнем конце основной колонки, образуя таким образом слой геля в основной колонке. После этого постепенно увеличивают скорость потока водного

0,2 мол/л раствора сульфата натрия при средней скорости увеличения давления 5 кг/см /ч в слое геля и при максимальной скорости увеличения давления 5 кг/см /мин в слое геля до тех пор, пока манометр, упомянутый в при- 35 мере 1, не покажет 26, 46 или

57 кг/см . Поддерживая указанное дой стигнутае давление, продолжают пропускать жидкость для заполнения через колонку в течение еще 2 ч. После это- 40 го отсоединяют загрузочное устройство и форколонку, а второй концевой фиттинг присоединяют к каждой колонке дпя фиксации слоя геля. Заполненные колонки испытывают в от- 45 ношении и характеристических свойств, и практического применения с получением благоприятных результатов. Характеристические свойства предлагаемых колонок представлены в таблице.

Все эти колонки имеют исключительный предел молекулярного веса (считая на декстран) около 30000.

На колонке l разделяют смесь коммерческих -глобулина, альбумина из сыворотки бычьей крови, альбумина из яичного белка и миоглобина, элюируют водным раствором с рН 7,0 0,3 мол/л хлористого натрия и О,1 мол/л фосфата натрия ° Каждый компонент выделен примерно на 1007.. Все эти протеины вымываются в порядке молекулярных весов.

На колонке 2 разделяют 100 мп (1 мг) водного 1 мас.Ж этиленгликоля, элюируют дистиллированной водой при 15 С и при скорости потока

1,0 мп/мин. Из полученной хроматограммы определяют ЭВТТ. Эту процедуру повторяют 800 раз. Величины ЭВТТ находятся в интервале 24,5-25,6 мм.

Стабильность величины ЭВТТ может рассматриваться как демонстрация продолжительного срока службы колонки и отсутствие какого-либо разрушения ее.

Через колонку 3 непрерывно пропус" кают водный 0,2 мол/л раствор сульфата натрия со скоростью 1,2 мп/мин в течение 240 ч, после чего определяют величину ЭВТТ, чтобы показать благоприятное значение 32,9 мм (ЭВТТ/Д =3,36). Не наблюдается разрушение колонки.

Пример 3. Разделяют человеческую сыворотку на соединенных колонках 1 и 2, которые были приготовлены в соответствии с примером 2, элюируют при рН 7,0 водным раствором 0,3 мол/л хлористого натрия и

О, 1 мол/л фосфата натрия при скорости потока 1,0 мл/мин, используя в качестве детектора ультрафиолетовый спектрофотометр при 250 нм (длина волны), На фиг. 3 показана хроматограмма нормальной человеческой сыворотки, полученная в соответствии с приведенной процедурой, а на фиг. 4 показана хроматограмма сыворотки при почечной недостаточности.

На одной и той же диаграмме две хроматограммы, которые были получены при различной чувствительности детектора, приведены для совместного показа основного и минимального компонентов сыворотки. Из этих хроматограмм можно сделать вывод, что жидкостная хроматографическая колонка

1471958

5

1О

35

45

55

1-—

Э согласно предлагаемому изобретению обладает отличной разрешающей способностью на вещества и что она особенно полезна для фракционирования смесей, содержащих много типов растворенных веществ, таких как кровь.

Пример 4, Загружают в колбу смесь 100 r винилацетата, 41,4 г триаплилизоцианурата, 70 r н-бутилацеI тата и 3,3 r 2,2 -азобисизобутиронитрила, проводят суспензионную полимериз ацию, переэтерификацию и классификацию по методике примера 2, получают гель, имеющий величину Др

9,4 мм. Гель имеет концентрацию гидроксильных групп 7,1 мэк/г и величину

W<, 1,20 мп/г. От этого геля отвешивают 13 г и заполняют ими колонку из нержавеющей стапи с внутренним диаметром 7,5 мм и длиной 500 мм по методике примера 1, получают заполненную колонку, которая имеет величину ЭВТТ/Д 2, 75 и величину V; /V

1, 55.

Проводят хроматографию на этой колонке сыворотки пациента, страдающего почечной недостаточностью, по методике примера 2 . с тем исключением, что анализ проводят с большей скоростью потока элюента. На фиг, 5 показ аны хромато гр амма, полученная при скорости потока элюента 1,0 мп/мин и хромато грамма, полученная при скорости потока элюента 2,0 мп/мин. Хроматограмма, полученная при такой высокой скорости потока элюента, как

2,0 мп/мин, что соответствует, 2,72 м/ч в величинах ЛС, четко показывает такое же высокое разрешение, как и на фиг. 5, т. е. на хроматограьг ме, полученной при скорости потока элюента 1,0. мп/мин. Следовательно, колонка, заполненная в соответствии с предлагаемым изобретением, обеспе-. чивает высокоскоростную хроматографию с высоким разрешением. Кроме того, даже после использования для хроматографии 150 образцов сыворотки крови при скорости потока 2,0 мп/мин колонка сохраняет исходное разреше-ние и эффективность, которые она показывала при ее приготовлении. Это доказывает длительность срока службы колонок, заполненных в соответствии с предлагаемым изобретением.

Пример 5. Проводят суспензионную полимеризацию смеси 100 r винилацетата, 32,2 г триаллилизоциану- рата (стелень сшивки 0,25), 40 г иI бутилацетата и 3,3 г 2,2 -азобисизобутиро нит рил а, фильтруют, э кст р а гируют, переэтерифицируют и классифицируют по методике примера 2, получают гель, имеющий величину Д 13 мм, Д /Д „1, 32, концентр ашю гидро ксип ьных групп 8,2 мэк/г и величину W

1,05 мп/г. Заполняют полученным таким образом гелем колонку с внутренним диаметром 7,5 мм и длиной 500 мм по методике пример а 1, получают з аполненную колонку с 3BTT/Jl 3,4 и

V /V0 1,20..Проводят хроматографию на этой заполненной колонке водной

I I смеси хлоридов N,N -диметил-4,4 -би- . пиридипия (NQ), N-метил-4- (4-пиридил) — пир идиния (MQ) и 4- метилпиридиния (МЯ), эту смесь получают во время приготовления сельскохозяйственно го химикат а, элюируют водным

0,3 мол/л хлористым натрием при скорости потока 1,0 мл/мин. Полученная хроматограмма приведена на фиг. 6, где четко показаны фракции смеси, Из этого можно сделать вывод, что колонка, заполненная в соответствии с предлагаемам изобретением, также эффективно применима для фракционирования и идентификации электролитов с низким молекулярным весом.

Фор мул а из обретения

1, Колонка дпя жидкостной хромато графин, содержащая цилиндрический корпус и слой полностью пористого гидрофильного геля, в состав которого входят фрагменты винилового спирта, отлич ающая ся тем, что, с целью повышения скорости хроматогр афирования, р азр ешающей способности колонки и обеспечения прямого анализа сыворотки и других компонентов крови, гель имеет средневе совой диаметр гранул 4-20 мм, величину влагоудерживания 0,6-2,0 мп/г и концентрацию гидроксильных групп 315 мак/г, а гельный слой имеет степень однородности ?, 0-4,0, определяемую через отношение эквивалентной высоты теоретической тарелки колонки к средневесовому диаметру гранул, и упаковочное отношение 0,66-0,78, определяемое по формуле

1471958 фиг.1 где VO - объем воды с наружной стороны гранул, Ч вЂ” общий объем колонки.

2, Колонка по и. 1, о тл и ч а5 ю щ а я с я тем, что гель выполнен из винилкарбоксил атно го гомополимера ипи сополимера.

3. Колонкапоп. 2, отлича- 10 ю щ а я с я тем, что сополимер является сополимером винилкарбоксилата, а сшивающий мономер содержит изоциануратиые кольца.

4. Колонкапоп. 2, отлича- 15 ю щ а я с я тем, что сополимером является сополимер винилкарбоксилата, а сшивающий мономер содержит циануратное кольцо.

5. Колонка поп. 3, о тл ич а- ?О ю щ а я с я тем, что сшиваюшдй мономер, содержащий изоциануратное кольцо, является триаллипизоциану,ратом.

6. Колонка по и. 2, о т л и ч аю щ а я с я тем, что винилкарбоксилатный гомополимер или сополимер выполнен из мономера, содержащего по

° крайней мере две сложно-эфирные груп- ЗО пы винипкарбоксилата.

7. Колонка по п. 6, о т л и ч ав щ а я с я тем, что мономером, содержащим по крайней мере две сложноэфирные группы винилкарбоксилата, является дивиниладипат.

8. Колонка по пп. 1-7, о т л ич а ю щ а я с я тем, что она имеет диаметр 4-50 мм и длину 100-600 мм.

9, Способ заполнения колонки для жидкостной хроматографии, включающий приготовление гельной суспензии в растворителе, содержащей 1,1-4,0 кратное количество геля, которое необходимо для заполнения колонки, подачу гельной суспензии в загрузочную аппаратуру с последующей ее герметизацией, соединение аппаратуры с колонкой, на концах которой установлены фитинги с фильтрами, пропускание потока жидкости через загрузочную аппаратуру и нижний фильтр колонки для продвижения суспензии, изменение скорости потока жидкости для .регулирования упаковочного отношения, отсоединение колонки от загрузочной аппаратуры и фиксацию гельиого слоя фитингом с фильтром на верхнем конце колонки, о тли ч ающий ся тем, что поток жидкости в объеме 1-300 внутренних объемов колонки пропускают с постоянной скоростью 0,2- 1,5 м/ч, после чего увеличивают скорость потока с обеспечением среднего увеличения давления 2-80 кг/см /ч и максимального увеличения давления до 60 кг/см /

/мин.

)471958

Rf

93 . 2

1471958

Щд,4 п

Cput. S

Составитель В. Толстых

Редактор Л. Гратилло Техред М.Дидык

Корректор С. Шекмар

Заказ 162 3/59 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул. Гагарина, 101