Векторная плазмидная днк polya15, предназначенная для клонирования чужеродных генов в клетках еsснеriснiа coli и bacillus spp., и способ его конструирования

 

Изобретение относится к генетической инженерии и связано с целью получения нового биреготиконного вектора . Сконструирована бирепликонная плазмида, предназначенная для клонирования фрагментов чужеродной ДНК в клетках Escherichia coli и 5 различных видов Bacillus spp. Для этого плазмиду рИС 19 подвергают частичному гидролизу эндокуклеазой Нра11, плазмиду рВС 16 расщепляют эндонуклеазой EcoR I, липкие концы фрагментов достраивают до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1, затем лигируют друг с другом, смесью молекул трансформируют штамм Е. coli, VM 83 и отбирают клоны с фенотипом Тс , Amp 1, LacZ, содержащие бирепликонную плазмиду, Из трансформантов выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционнын анализ и отбирают плазмиды минимального размера. Одна из отобранных плазмид имеет мол. м. 4,2 Ttn.o., которую обозначают pOLYA 15. Она состоит из участка плазмиды рИС t9 размером 1,7 т.п.о., ограниченного Нра Ц-фрагментами размером 404 и 34 nto, и содержащего последовательность ori V, ген lac Z 7 с полилинкерной последовательностью, включающей сайты для 10 рестриктаз (EcoRI, Sad, Kpnl, Sma.I, Bam H.I, Xba I, Sal I, PstI, SphI, Hinl III). Вторым компонентом гибридной плазмиды является EcoR I-фрагмент плазмиды рВС 16, несущий ori V этой плазмиды и ген резистентности к тетрациклину Тс размером 3,1 т.п.о. Полученная гибридная плазмида стабильно наследуется как в клетках Eecherichia coli, так и в клетках Bacillus spp. 2 с.п. ф-лы. I (Л с й о оо со оэ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

7 896 А1

{191 {11) (51)5 С 12 N 15 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д BTOPCHOM JJ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П.{НТ СССР (46) 23. 09. 90. Бюл. Ф 35 (21) 4277204/28-13 (22) 06.07 ° 87 (71) Всесоюзный научно исследовательский институт прикладной микробиологии (72) Д.В.Шевченко и A.П,Добрица (53) 575.224.2 (088.8) (56) Iullivan М.А., Jasbin R.S., Joining Г,Е. New shuttlе vectors for

Bacillus subtilis and Fscherichia

cali with allow rapid detertion of

inserted fragment. Gene, 29(1984), р,р .,21-26, (54) ВЕКТОРНАЯ ПЛАЗИИЦНАЯ ДНК р01ЛА15, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COL I И BACILI.VS SPP °, И СПОСОБ

ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к генетической инженерии и связано с целью получения нового бирепликонного вектора. Сконструирована бирепликонная плаэмида, предназначенная для клонирования фрагментов чужеродной ДНК в клетках Escherichia coli и 5 различных видов Bacillus spp. Для этого плазмиду рИС 19 подвергают частичному гидролизу эндонуклеазой Нра11, плазмиду рВС 16 расщепляют эндонуклеаэой

EcoR I, липкие концы фрагментов до1

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой биреп". ликонную векторную плазмиду, обладающую способностью стабильно поддерживаться в автономном состоянии в клетках Eschexichia coli и бацилл и пред». страивают до. тупых с помощью фрагмеи. та Кленова ДНК-нолимеразы t затем . лигируют друг с другом, смесью молекул трансформируют штамм Е. coli VN

83 и отбирают клоны с фенотипом Тс{, Amp", LacZ, содержащие бирепликонную плазмиду, Hs трансформантов выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и отбирают плаэмиды минимального размера. Одна из отобранных плазмид имеет мол, м. 4,2 т,п.о., которую обозначают р01,7А 15. Она состоит из участка плазмиды рИС 19 размером 1,7 т.п.о, ограниченного Нра, II-фрагментами размером 404 и 34 п.о, и содержащего последовательность

ori V, ген lас Z ? с полилинкерной 3 последовательностью, включающей сайты для 10 рестриктаз (EcoRI, SacI, 4

RpnI, Sma.. I, Bam Н. I, Xba I, Sal

Ps tI, Sph I, Hinl III) Вторым компонентом гибридной плаэмиды является Я

LcoR I-фрагмент плазмиды рВС 16, несущий ori Ч этой плазмиды и ген резистентности к тетрациклину Тс раэ-.

{ мером 3, 1 т ° и. о, Полученная гибридная плазмида стабильно наследуется (Ъ как в клетках Escherichia coli, так РО и в клетках Bacillus spp. 2 с.п, сО ф-лы. ОЪ

2 назначенную дпя клонирования чужерожных фрагментов ДНК в клетках этих бактерий, и способ конструирования данной плазмиды.

Целью предлагаемого объекта изобретения является создание более удобного "челночного" вектора> на основе

14?6896 которого может быть осуществлено клонирование чужеродных фрагментов ДНК как в клетках L,coli. для которой приемы генетического манипулирования наиболее отработаны, так и в бактериях большинства видов р. Bacillus, Удобство в работе с этим вектором связано с небольшим размером его (4,.8 т.п.о,), доступностью для клонирования 10 участков узнавания различных эндонуклеаэ, включая одновременное наличие Eco RI u Hind III " сай . тов, наличием маркеров резистентности к тетрациалину и воэможностью использовать в качестве хозяев Е.coli, В.thuringiensis В.cereus В,subtilis, и В.megaterium, .Пример 1. ДНК плазмид рИС19 и рВС16 выделяют следующим образом..

Культуры клеток Е.coli ЧМ 83, содер20 жащих рИС19 и .В.subtilis несущих рВС16, выращивают в 15 мл среды LB (триптон 10 г, дрожжевой экстракт

5 г, NaC1 8 г, вода 1 л), дс конца логарифмической фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 2 С), ресуспендируют в 0,5 мл лизирующего раствора (лизоцим 2мг/мл>

ЭДТА - Nay 10 мМ, глюкоза 50 мМ, трис.-НС1 25 мИ, рН 8,0). Через 5 мин

30 инкубации суспензии на ледяной бане при температуре О-2ОC прибавляют

1 мл раствора, содержащего 17. додецилсульфата натрия (SDS), и 0,2 ц.

Na0H, и лизат осторожно перемешивают. 35

Затем вносят 0,75 мл ЗМ НаСН СООН, лиэат перемешивают и вьдерживают 1 ч при 0-2 С. Клеточные остатки удаляют центрифугированием (10000 g, 15 мин, 2 С). К супернатанту добав" ляют 2,5 объема охлажденного до

-20 С этилового спирта и через 2 ч инкубации при -20 С выпавший осадок

ДНК собирают центрифугированием

)5000 5 мин), ДНК растворяют. в

0,9 мп воды, прибавляют О, 1 мп 3М

NaCH.„.ÑÎ0Í, рН 7,0 и снова осаждают этиловым спиртом. Эту операцию повторяют еще раэ, осадок ДНК слегка додсушивают потоком воздуха и раство"50 ряют в 0,2 ип 10 мИ трис-НС1, 1 мМ

ЭДТА, рН 7,5..

2 мкг ДНК плазмиды рВС16 расщепляют рестриктазой Eco RI (3 ед,),в

40 мкл буфера следующего состава: 55

100 мМ трис-НС1, 50 мИ NaC1, 10 мИ

МфС1 1 мМ дитиотрептол (ДТТ), рН

7,5. ДНК плазмиды рИС19 (пять образ" цов - по 2 мкг) гидролизукт эндонуклеаэой Нра Il (1 ед; 0,2 ед, 0,04 ед, 0,008 ед. и 0,00016 ед, на образец) в 40 мкл 1О мИ трпс-НС1, 10, мМ.MgC., 1 мМ ДТТ, рН ?,5. Реакции ведут 1 ч . при 37 С и останавливают прогреванием о инкубационной смеси при 65-70 С в течение 10 мин. Анализ полноты гидроо лиза проводят с помощью электрофореза.

Для достраивания ("затупления") липких концов Есо RI — фрагментов

ДНК рВС16 и Нра II — фрагментов ДНК рИС19 фрагменты (пл 2 мкг) смешивают и обрабатывают в 40 мкл инкубационной смеси, содержащей 50 мМ трис-НС1, рН 7,2, 10 мХ MgSO<, 1мМ ДТТ,50 мкг/мп бычьего сывороточного альбумина, 4 нмоль каждого dNTP (dATP, - dCTP, dGTP, dTTP и 2 ед. фрагмента Кленова

ДНК-полимеразы I, Реакцию ведут в течение 1 ч при комнатной температуре и останавливают добавлением 2 мкл

0,5 И ЭДТЛ, Затем проводят депротеи-. низацию смесью фенол — хлороформ и осаждают ДНК.2,5 объемами спирта (-20 С, 12 ч) .

Eco RI — фрагменты ДНК рВС16 (1,5 мкг) и фрагменты ДНК рИС19 (I 5 мкг), полученные в результате ее частичного гидролиза Нра (средняя величина фрагментов 1-2 т.п.н,), сое" диняют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в среде, содержащей 50 мМ трис-НС1, рН 7,5, 25 мМ NaC1, 10 мМ MgClq, 10 мИ ДТТ, 0,5 мМ ATPр 20-40 мкг/мл

ДНК, 1-2 ед/мл ДНК-лигазы фага Т4, Смесь вьдерживают при температуре

-4 С в течение 4-16 ч, затем снижают концентрацию ДНК в 5-10 раз и продолжают инкубацию в течение 12-24 ч, Эффективность соединения фрагментов

ДНК контролируют электрофаретическим анализом. о

Лигированной ДНК трансформируют обработанные CaC1 g клетки Е.coli

JM 83 или клетки аналогичного штамма, имеющего такие генетические характерисипж, как d (lac pro), F tra D36, pro АВ, lac I, Z. M15. Са -клетки

Е.coli получают следующим образом:

0,1 мл ночной культуры вносят в 10 мл среды LB и вырашивают при температуре 37 С со встряхиванием на качалке до титра 3 1О кл/мп. После охлаждения культуры на ледяной бане (О С, 10 мин) клетки центрифугируют (5000 g, 10 мин, ООС), суспендируют в 10 мп

5 1476896 6

0,1 М СаС! g и «ыд«1>жпванл ч. Клетки буфер. Этот же буфер используют и при повторно центрнфугируют (5000 последуюшей отмывке протопластов и

10 мин, 0 C), затем ресуспендируют приготовления разведений протопласв 0>5 мл О, 1 !! СаС!>> 0 С. На следую- тов. Для трансформации берут в рабоший день 0,1 мл Са -клеток смешивают " ту 0,5 мл суспензин полученных протос 0,05 мл ДНК (10 мкг/мп), инкубируют пластов, смешивают с ДНК, растворен-.

1 ч при температуре О-2 С и 5 мин ной в SMMP буфере,н добавляют 1,5 мп при температуре 42 С и затем перено- полиэтиленгликоля (ЛЭГ). После pasсят в пробирку с 1,5 мл среды LB. 10 бавления в 5 мп SMMP буфера клетки

После 2 ч инкубации в этой среде при центрифугируют и ресуспендируют в

37 С со встряхиванием клетки высева- 1 мп SMMP буфера. Через 1,5 ч суспенют на чашки с индикаторными (Ьас) зию высевают на чашки Петри со средой средами, содержащими тетрациклин ДМЗ. Чашки инкубируют при температуре о (15 мкг/мл) . В качестве индикаторных !6 37 С в течение 2 сут, Колонии, обрасред используют среду Мак-Конки или зованные.регенерировавшими протоплассреду с Xgal (5-бром-4-хлор-3-индо- тами, перекалывают на LB-агар, дополлил- -галактозид). Lac -клетки форми- ненный тетрациклином (15 мкг/мл). руют на этих средах, темно-красные Частота трансформации составляет окои синие колонии соответственно. Коло" 20 ло,20Х.. нии, имеющие такую окраску; перекалы- Получают протопласты В. thuringienвают последовательно на агаризованную sis var. gelleria 69/6 и трансформисреду LB, содержащую тетрациклин руют их ДНК плазмиды рОЬ УА 15 следу(15 мкг/мл) и ампициллин (100 мкл/мл), ющим образом: ночную культуру развои агаризованную среду ЬВ с тетрацик- 2б дят в 20 раз в среде 0,15 (на 10 л линам (15 мкг/мл). Чашки инкубируют Н О трис-основание 150 г>КС1 430 .мг, о 1 в течение 18 ч при 37 С. НН.>С1 12,5 r> NaC1 725 мг, Ма>$0 >

Из клеток клонов с фенотипом r!0H O 3,75 г, FeC1 . 4H25 мг, Тс Lac Ар выделяют плазмидную ДНК.

> + 5 сахароза 513-5 r, йосле автоклавироВыделенную ДНК и ДНК плазмид рИС19 30 вания добавляют 100.мл 10Х"ного дрожи рВС!6 обрабатывают рестриктазами жевого экстракта, 100 мл О, 1 М

Есо RI и Нра П и анализируют с по- КН РО > 100 мп 2M MgClq и 50 мл 40Хмощью электрофореза в агарозном или ной глюкозы), Лодращивают культуру полиакриламидном геле. В качестве при температуре 32 С до оптической маркеров размера ДНК используют плотности 0,7 ед (550 нм). Клетки

Есо RI> }linc! III и Есо RI+Hind III — центрифугируют (3000 g, 15 мин) и фрагменты ДНК фага и Есо ВТ вЂ” фраг-, ресуспендируют в 1/10 первоначальноменты ДНК плазмиды pBR 322, После го объема среды О, 15, содержащей отбора кпонов с плазмидами, имеющими 5.мг/мп лизоцима. Культуру инкубируют минимальный размер (около 4>8 т,л.н.): в течение 60 мия при температуре

40 о проводят- также анализ структуры 37 С, затем протопласты собирают цен» этих.плазмид с помощью других рест- трифугированием (3000 я, 20 мин) и риктаз, в частности рестриктаз„ сайты ресуспендируют в 1/50 первоначального которых входят в полилинкерную пос- объема среды 0,15. К О,i мл плазмидледовательность рИС19. ной ДНК, растворенной в среде О, 15>

Пример 2. Проверку возможно- добавляют > 0,5 мп суспензии прото45 сти репликации плазмиды рОЬ YA 15 в пластов, а затем сразу же 1,5 мп клетках бацилл проводят следующим 40Х-ного раствора ПЗГ. После тщаобразом, тельного перемешивания смесь разбавПолучают компонентные клетки ляют в 5 мл среды О, 15, Протопласты

В.subtilis и трансформируют их ДНК ВО собирают центрифугированнем и ресус плазмнды pOL YA 15. Отбор трансфор- .пендируют в 2 мл среды 0>15. Образцы мантов проводят на чашках с агари- переносят на поверхность 1 -ной агазованной средой LB содержащей тет- ризованной среды 0,15 и инкубируют рацнклин (15 мкг/мл). Частота транс- 2-3 ч при температуре 32 C. Для регеформации составляет 10 . 66 нерации протопласты переносят в

Получают протопласты В.megaterium. 0,4Х-ную агаризованную среду 0,15 H

KM и трансформируют их ДНК плазмиды высевают на поверхность той же ореды, рОЬ YA 15. Для этого используют $ММР содержащей .1 . arapa и тетрапиклин

1476896

Составитель С.Дикарев

Редактор Л.Павлова Техред А.Кравчук

Корректор С.Черни

Заказ 3331 Тираж 492 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 (20 мкг/мл) . Частота трансформации

10 -10

Из клеток В,thuringi.ensis чак.

galleria 69/6 (pOLYAI5) в клетки

В.thuringiensis var. Kurstaki Ю".:

str " плазмиду pOLYA15 передают путем трансцепции при совместном культивировании донорского и реципиентного штамма. Для этого исходные жидкие культуры по 0,2 мп засевают на чашки

ИПА и культивируют в-течение 18 ч при температуре 37 С. Ресуспендируют полученную совместную культуру в

1 мл среды до конечного титра 10 кл/

/мл. Высевают полученную суспензию да 0,2 мл на чашки с ИПА, содержащие

100 мкг/мл стрептомицина и 20 мкг/мл тетрациклина. Аналогичным образом поступают при передаче плаэмиды

pOLYA15 "нэ В. thur ingiensis var.

Kurstaki HDI В.cereus 968 Rif

Ча стота пер е но с а около 10 ".

Для определения автономного состояния плазмнды pOL УА15 в бациллах ,иэ клеток трансформантов и трансципиентов выделяют плазмидную ДНК и про-. водят ее электрофоретический анализ, В качестве контроля используют ДНК плазмиды pOL YA15.

Стабильность поддержания плаэмиды . pOLYA15 в клетках бацилл определяют

;по величине процентного содержания . тетрациклинрезистентных клонов транс формантов и трансципиентов после их выращивания в неселективных условиях. 35

Полученные штаммы не утрачивают плаз,миду pGL YA15 в течение 60 генераций.

Пример 3, Для конструирования гибридных плазмид на основе

pOL YA15 ДНК этой плазмиды гидролизуют одной из рестриктаз, сайты которых находятся в полилинкерной последовательности, и объединяют путем легирования с фрагментами чужеродной

ДНК. Лигированной ДНК трансформируют 45

Са -клетки Е,coli VM 83 или аналогичного штамма, как описано в приме,ре 1. Отбор трансформантов с рекомбинантными плазмидамн ведут по Тс"Lac — фенотипу.

Формула изобретения

1, Векторная ллаэмилная ЕШК pOLYA15, предназначенная для клонирования чужеродных генов .в клетках

Escherichia cali u Bacillus spp., размером 4,8 т,п.о., содержащая участок плазмиды рИС19 — 1,7 т,п.о., фланкированный Нра II-фрагментамч размером 404 и 34 п.о., с последовательностью огх Ч, необходиМой для репликации плазмиды, геном lacZ и полилинкерной последовательностью, включающей сайты для 10 рестриктаз, пригодные для встраивания фрагментов чужеродной ДНК;

Eco RI-фрагмент плаэмиды рВС16, несущий ori V этой плаэмиды и ген резистентности к тетрациклину, размером 3,1 т,п,о., емкостью до

10 т.п.о. уникальные сайты рестрикции:EcoRI, SacI, KpnI, Sma I, BamHI, XbaI, Sal,I, Pst I, Sph I u Hind III; генетические маркеры: ген устойчивости к тетрациклину-Тс, ген устойчивости у ампициллину-Amp ", генLacZ емкостью до 10 т.п,н.

2. Способ конструирования вектор- . ной плазмидной ДНК pOLYAI5, заключающийся в том, что ДНК плазмиды рВС16 расщепляют эндонуклеазой EcoRI, ДНК плазмиды рИС19 подвергают частичному гидролизу эндонуклеазой Нра II, лип" кие концы Есо RI и Нра II-фрагментов затупляют с помощью фрагмента Кленова

ДНК-полимеразы I и сшивают в результате обработки ДНК-лигазой, затем смесью молекул трансформируют штамм

E.ño1i 7И 83, проводят селекцию клонов с бирепликонными плазмидами по фенотипу иэ трансформантов с таким фенотипом, выделяют плазмиды, осуществляют их рестрикционный анализ и отбирают плаэмиду с минимальныи размером 4,8 т,п.о.