Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклональных антител к тяжелым @ -цепям иммуноглобулина человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для тестирования иммуноглобулинов человека (JGM). Цель изобретения - повышение специфичности моноклональных антител. Для получения штамма мышей иммунизируют JGM человека. Через 3 дня клетки селезенки иммунных мышей гибридизуют с клетками миелассы мыши Х63-Ад8-653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 74 D И ПРОДУЦИРУЕТ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, ОТНОСЯЩИЕСЯ К JGG 1 КЛАССА. НА 3-4-Й ДЕНЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУКЦИЯ АНТИТЕЛ 15-20 МКГ/МЛ СРЕДЫ И 5 МГ/МЛ АСЦИТНОЙ ЖИДКОСТИ. ПРОДУКЦИЯ СОХРАНЯЕТСЯ ДО 20 ПАССАЖЕЙ IN VITRO И 3 ПАССАЖЕЙ В АСЦИТНОЙ ФОРМЕ. 2 ТАБЛ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (П) (5D4C1N50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ряют через 23 дня, вводя внутрибрюшинно 200 мкг того же препарата в ,ЗФР без адъюванта. Через 3 дня после этого 1х10 клеток селезенки им8.

7 мунных мышей гибридизуют с бх10 клеток миеломы мыши Х63-Ag8-653 помощью 0,4 мл 45%-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы

2000, содержащего 10% диметилсульфоксида, в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели по 2х10

У клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду

RPMI-1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% телячьей эмбриональной

-а сыворотки, 10 М гипоксантина, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4352834/28-13 (22) 30.12.87 (46) 15.07.89. Бюл. М- 26 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) Е.JI Aðñåíüåâà, Г.Т.Богачева, А.P.Èáðàãèìîâ, Н.Ю.Лабазинар

В.В.Черепахин и О.В.Рохлин (53) 578.085.23 (088 ° 8) (56) Рои1еtty Ph.et al — J.lmmunol.

Methods, 1985, ч.76, р.289-298.

ЕР 1(- 0161638, кл. С 12 Р 21/ОС, 1986. (54) IIITAMM ГиБРиДных культиВиРУемых

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ M(IS Мисс(РЫБ-ПРО РЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТЯЖЕJIbIM P -ЦЕПЯМ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для тестирования иммуноглобулинов человека (IgM) .

Цель изобретения — повышение специфичности моноклональных антител.

Штамм — продуцент моноклональных антител (МАТ) получают следующим образом.

Мьппей линии BAL В/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 200 мкг препарата IgM человека (поликлональный) в 0,5 мл физиологического растворар забуференного фосфатами (ЗФР) (5 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,27,4, 150 мМ МаС1), с полным адъювантом Фрейнда. Иммупизацию повто2 (57) Изобретение относится к биотек. нологии и может быть использовано для тестирования иммуноглобулинов человека (IgM). Цель изобретения повышение специфичности моноклональных антител. Для получения штамма мышей иммунизируют IgM человека.

Через 3 дня клетки селезенки иммунных мьппей гибридизуют с клетками миелассы мьппи Х63-Ag8-653. Штамм депонирован под номером BCKK(II)

И 74D и продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к IgG I класса. На 3-4-й день культивирования продукция антител 15-20 мкг/мл среды и 5 мг/мл асцитной жидкости. Прое дукция сохраняется до 20 пассажей

in vitro в 3 сассавер в асцитвар фар- Q) ме. 2 табл.

С:

1493668

4х10 М амнноптерина и 1,6х10 М тимидина. Гибриды — продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высеная по 1 клетке в лунку, Ф содержащую 4х10 клеток селезенки.

После двух клонирований практически

100% субклонов продуцируют антитела к IgM.

Полученный штамм обозначают 10

9С11В8-1, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных

Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) Р 740 и характеризуется 15 следующими признаками.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования .

Среда RPMI-1640 или DMEM с 10Х 20 донорской телячьей сыворотки, 4 мм

L ãëóòàìèíà, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола, при 37 С и в атмосо фере 5!-ного СО . Дпя выращивания штамма использовали пластиковую посуду; посевная доза — 100 тыс ° клеток и» 1 мл, клетки пассировали один раэ в 3-4 дня, кратность 1,3ññåíà- 1:10.

Культура суспензионная. 30

Культивирование в организме животных.

Для выращивания асцита пригодны мыши BAL В/с. Мышам за 7-10 дней до инъекции клеток штамма вводят внутри- 35 брюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки

6 инъецирувт внутрибрюшинко по 2-5х10 клеток н 1 мл среды Игла. Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. 40

Секреция моноклонального антитела на 3-4 день культивирования составляет 15-20 мкг н 1 мл культуральной среды и 5 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении методом торможе- 45 ния радиоиммуноадсорбции.

Характеристика полученного продукта

Штамм продуцирует моноклональное антитело, относящееся к IgG I класса ° Специфичность — IgM человека.

Методы оценки сохранения специфичн«сти: тест на связывание монАТ иммобилиз< г аяным ЕВМ человека (радиоиммунный «нализ — КЕА).

Лнтиген наносят на пластик, 2 мкг н 100 мк ЗФР (см.описание штамма) и HHIi :6Il»óíï н течение ночи. Затем, посл . «тм и ки, наносят тестируемую культуральную среду и после инкубации и отмывки определяют количество сорбированных антител мечеными 125< кроличьими антимышиными антителами.

Все отмывки ведут ЗФР с 0,057.-ным

Тнин-20. Контролем служат нормальные иммуноглобулины мыши.

Продукция монАТ сохраняется как минимум до 20 пассажей in vitro u до 3 пассажей в асцитной форме.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма заморакивают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 102 диметилсульфоксида. Режим замораживания: 4 "/мин о, о о до 4 С затем 1 /мин до -40 С ° После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание — на водяной бане при +37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания—

70-80% по окрашиванию трипаноным синим.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательньге среды. Заражение микоплазмой не выявлено методом гибридизации рестриктов клеточной ДНК с универсальным и видоспецифическими диагностическими зондами, содержащими фрагменты геномов различных миксплазм.

Моноклональное антитело, продуцируемое клетками штамма 9С11В8-1, относится к Ig G1 подклассу и связывается с эпитопом Ь -области тяжелой цепи р -класса иммуноглобулина человека. Специфичность взаимодействия монАТ может быть выявлена способом, при котором в качестве антигенов используют иммуноглобулины человека, иммобилиэонанные на пластике (тнердофазный радиоиммунный или иммуноферментный анализ).

Иммунохимические свойства МАТ

9С11В8-1. Для получения препарата

МАТ н количестве, необходимом для проведения всех иммунохимических исследований, гибридомные клетки штамма-продуцента помещают в пластиковый флакон площадью 25 кв. см, 5

2х10 клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с 10/ эмбриональной телячьей сынороткой, 4 мМ глютамина, 100 мкг-мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки куль-. тивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 5%-ного СО . Полученный супернаТаким образолг, приведенные примеры четко демонстрируют абсолютную специфичность ИЛТ 9С11В8-1, относящегося к 1ВС! классу мь шикых иммуно1 493668 е такт испсггьзуют в качестве стве реагента ИЛТ для вь:явления иммобилизованного в иммукохимических реакциях. актигена с помощью радиоиммунохимиII р < м е р 1 ° Тестирование специ- ческого метода. фичггости взаимодействия монАТ с анти- П р р и м е р ° естирование спе2 ° Т генами методом тве рдофазного радио- цифичности взаимодействия монЛТ с иммукого анализа актигеном методом твердофаэного имНа полихлорфиниловую 96-ячеечную муноферментного анализа (ЕЫБА). панель (Flow) я ми

) для микротитрования Для проведения иммунохимических сорбируют антигек — 2 мкг. на ячейку 1р реакций в системе ЕЫ$А на полив 100 мкл ЗФР п и 4 С н р 4 С в течение ночи. стирольную панель сорбируют антиген

После насыщения панели 0,05Х-ным (10-20 мкг/мл в 50 мкл ЗФР) в ЗФР раство ом Твин-20

p — 0 в ЗФР для уменьше- в течение ночи и после отмывки инния неспецифического связывания ан- кубируют 1-2 ч при 37 С в ЗФР с 1Хтител с пластиком в ячейки я .ейки вносят 15 ным BSA для снижения неспецифической по 100 мкл кчльт ально ур л ной среды штам- сорбции. Тестируемую культуральную ма 9С11ВЯ и икк б кубируют 1 ч при 20 С. жидкость наносят в объеме 50 мкл о

После этого панель отмыв отмывают три раза и инкубируют в тех же условиях. Поспо 250 мкл ЗФР с 0,05i. -кым Твин-20 ле отмывок ЗФР с 1Х-ным BSA проявлеи вносят антитела к олин к р ика к иммуно- 2р ние ведут раствором кроличьих антиглобулинам мыши меченые тел к Ig мыши, конъюгированных с пепарат с удельной активностью активностью 0,8х10 роксидаэой хрена. Ферментативную срш на мкг по 0 2х 0 с ш

i cpm в 100 мкл реакцию с ортофекилендиамином (OPD)

ЗФР с 0 05Х-ным Твин-20 останавливают через 10 мин 4н. Н SO

После иккубации в течение 1 ие 1 ч при 25 Раствор субстрата для проявления пе2 4

20 С панель т и ы и амы р жд рамывают ЗФР роксидаэой активности готовят: 5 мг с 0 05Х-ным Твин-20 и

0 просчитывают OPD растворяют в 10 мл буфера (сосна Minigamma счетчике. тав буфера — 24 мл 0 1 M лимонкой

Э

Результаты опыта по изучению спе- кислоты 26 0 2 М N НРО 50 р мл р а р ил цифичкости связывания ИЛТ и

ИЛТ, продуци- Зб Н О). Непосредственно перед проведеруемого клетками штамма 9С11В8-, с кием реакции к раствору OPD добавактигеками, сорбироваккыми ка пласти- ляют 10 мкл перекиси водорода. ке, представлены в табл.1. Данные, получеккые иммукоферментВ качестве отрицательного контро- кым методом, приведены в табл.2, ля, учитывающего возлгожнув кеспеции . p ц гм контролем является

35 Or и ательнь. тел мыши ка акткгеках, использована фермекткая реакция прк кепос е ст.ц р : осредсткультуралькая среда, реагирующая венной сорбции на актиген х р ц игенах конъютолько с иммукоглобулкка 1Н гаммагата пероксидаэы х ена с р ид р на с актителами

40 и ы кролика к Ig мьпди. еспеци ическую сор цию меченых

Цифры в скобках означают число антител кролика против 18 мыши антигенов, на которых наблюдается (анти-Ск) определяют путем их инкууказанная реакция (числитель) иэ бации непосредственно с иммобилиэовсех использованных антигенов расванными антигенами; уровень фона сматриваемого класса-подкласса (зна45 мекатель). составляет 300-900 имп/мик для разных антигенов. Цифры приведены эа

Результаты Е у LISA показывают, что вычетом фона неспецифической сорбположительна я ре акция к аблюдае тс я только с ?сМ человека. Отсутствие

Данные, приведенггые в табл.1, реакции г Р(аЬ) -ф аг ц (b)) „„ фрагментом при четко показывают, что реакция с 1я М

50 положите .ькой еак ии с F— р .ц ш с 4 -фрагмек- в 15-20 раз превышает реакцию с антитом молекулы IgM свидетельств ет что эпитопмишень локализован на о генами, ке имеющими эпитоп-мишень ан на одном из постоянных доменов f4 -цепи

3 норм и 1 норм (кроме С< Н) „

Результаты этого примера свиде55 тельствуют о высокой специфичности моноклокалького ан .пгела, вырабатываемого клетками mrамма 9011В8-1, и показывают возможкО< тh применения

1493668 ность получения асцитной формы штамма в линейных мышах.

Формула изобретения

Таблица 1

Тестирование специфичности монАТ 9С11В8-1 методом РИА, имп/мин

Антитела, имп/мин

Антигены: lg человека

MAT 9С11И8-1, Культ. среда анти-lg С, 15700

450

20700

1g Снорм норм

lgM БОБ

1gM КИР

1gM поликл.

Т а блица 2

Культуральная среда штамма

9С11В8

Антигены: миеломные белки человека

Составитель Г.Смирнова

Техред А.Кравчук Корректор А.Обручар

Редактор М.Товтин

Заказ 4066/28 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина,101 глобулинов, в отношении человеческих иммуноглобулинов класса IgM и возможность применения МАТ в различных вариантах иммунохимического анализа (радиоиммунный и иммуноферментный).

К важным для практики свойствам

МАТ 9С11В8-1 относится способность окрашивать лимфоциты периферической крови человека методом непрямой иммунофлуоресценции, а также возможlg 01 К,а

lg Сз К,S

1g G4 К

1gEK

1gA1 К

lg А2 К

F (ab) a ««

lg М К, Э

Рс

F (аЬ) q jU

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (II) N 74D - продуцент моноклональ1р ных антител к тяжелым р -цепям иммуноглобулина человека. — (4/4)

-(2/2) — (1/1) — (1/1)

-(2/2) — (1/1)

+(2/2)

+(1/1)

-(1/1)