Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus- продуцент моноклональных антител к гемагглютинину вируса гриппа а/ленинград/385/80 (h3n2)

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к медицинской вирусологии. Целью изобретения является получение гибридомного культивируемого штамма клеток, продуцирующего моноклональные мышиные антитела к гемагглютинину - поверхностному гликопротеину вируса гриппа А /Ленинград/ 385/80 (H3N2). Для этого сливают клетки мышиной миеломы Х63-AQ 8-653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных препаратом гемагглютинина вируса гриппа А /Ленинград/ 385/80 (H3N2). Полученный штамм культивируемых гибридных клеток имеет стабильные характеристики и депонирован в коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 157Д. Продуцируемые им моноклональные антитела обладают высокой специфичностью, взаимодействуя только с штаммом вируса гриппа А/Ленинград/ 385/80 и не реагируя с другими штаммами вируса гриппа, относящимися к типу H3N2. 1 ТАБЛ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК 2

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4307632/30-13 (22) 23.07.87 (46) 15.05.89. Бюл. Р 18 (71) Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР и Крымский медицинский институт (72) И,A.Ïîïîâ, А.В.Червонский, IО.С.Кривошеин и 10.Л.Криворутченко, (53) 616.98:578(088.8) (56) Ямникова С.С., Дуглас A.P Скеил Д .Д °, Закстельская Л.Я., Яхно М.А. Использование моноклональных антител для антигенного анализа гемагглютининов вирусов гриппа (НЗИ2), изолированных в СССР в 1979 †19 годах. — Вопросы вирусологии, 1980, - 5,. с. 555-558. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ %18 %1БС1П ЦЯ вЂ” ПРОДУЦЕНТ IIOFIOKII0HAJIbFIIIX АНТИТЕЛ К ГЕМАГГЛ10ТИНИНУ ВИРУСА ГРИППА А (ЛЕНИНГРАД) 385/80 (F131<2) (57) Изобретение относится к биотех1

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к медицинской вирусологии., Цель изобретения — получение гибридомного культивируемого штамма клеток, продуцирующего моноклональные мышиные антитела к гемагглютинину— поверхностному гликопротеину вируса гриппа А (Ленинград)385/80 (H3N2).

Полученный штамм гибридных клеток обозначен AH-PCI(-4Н8.

Штамм хранится в коллекции клеточных культур Института Цитологии

AFI СССР (Ленинград) под номером 157D.

1511 а С 12 N 5/00 5/02 нологии, а именно к медицинской вирусологии. I,елью изобретснпя является получение гибридомного культивируемого штамма клеток, продуцирующего моноклональные мышиные антитела к гемагглютинину — поверхностному гликопротеину вируса гриппа А (Ленинград) 385/80 (НЗИ2). Для этого сливают клетки мышиной миеломы(Х63 Aq8653 с клетками селезенки мьш.ей, иммунизированных препаратом гем ггглютинина вируса гриппа А (Ленинград)

385 80(113ih2) ° Полученный штамм культивируемых гибридных клеток имеет стабильные характеристики и депонирован в коллекции клеточных кул.ьтур

Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 15!D. Продуцируемые им моноклональные антитела обладают высокой специфичностью, взаимодействуя только с штаммом вируса гриппа А (Ленинград)385/80 и не реагируя с другими штаммами вируса гриппа, относящимися к типу FI3N2. 1 табл.

Штамм имеет следующие паспортные характеристики, Культуральные свойства. Среда для культивирования — среда КРМ1-1640 или минимальная среда Игла в модификации Дальбенко с "îáàâëåíèåì 207. эмбриональной телячьей сыворотки, 2мМ глютамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина; рН 7,4, 37 С; 57 углекислоты в атмосфере или без углекислоты. Посевная доза

10 клеток в 1 мл. Для выращивания штамма можно использовать стеклянную или пластиковую культуральную посуду.

1479510 о

Во флякон обbeMÎM 25 см засевают

5 .10" — 10 клеток штамма в. 5 мл среды.

Проводят пассаж 1 раз н 4 дня той же дозой клеток, Без подсчета клеток 5

1:3-1:5, Через 3-4 дня концентрация антител в культуральнсй жидкости достигает 30-40 мкг/мл.

Для выращивания опухоли из штамма используются мыши линии BAL В/с. Све- 1ð жим мышам за 5-25 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно

0,5 мл пристана. Клетки штамма инъецнруют внутрибрюшинно по 5 х 10 клеток на мышь в 0 5-1 0 мл среды 199. 15

Асцитическую жидкость собирают по мере появления (ня 12-14 день) многократно от жиных мышей. Делают не менее трех взятий от каждого животного, объем асцита 4-6 мл. Концентрация 20 антител н ясцитической жидкости 6,07,5 мг/мл, при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции. Из асцита штамм перевивается на свежих мышей по 5 х 10" клеток на мышь. 25

Кариологическая характеристика.

Модальное .число хромосом н клетках описынаемого гибридомного штамма 78 с.областью варьирования от 76 до 86.

Продуктивность, Стабильная секре- ЗО ция полезного продукта сохраняется до 30 пассажей in vitro с концентрацией антител в культуральной жидкости

30 мкг/мл и до 6 пассажей in vivo c с концентрацией антител в асцитической жидкости 6,0 мг/мл, Контаминация. Г>актерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено по окрашиванию красителями на

ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде.

Криоконсерниронание. Клетки штамма ресуспендируют н бычьей сыворотке, содержащей 107-. диметилсульфоксида (концентрация клеток 5 10 -10 клеток

6 (в 1 ил), разливают н пластиковые ампулы при 4 С, помещают с толстостенную коробку из полипеноуретана и выдерживают 24 ч при -70 "С, затем клетки перено-5О сят на хранение н жидкий азот, Возможно также программное замораживание со снижением температуры на 1"С в

1 мин до -40 С с последующим перено55 сом н жидкий язот.

Разморяжинянпе осуществляется н течение 3 глин при 37 С. Клетки разводят в 10 мя среды для культивирования, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды и переносят в посуду для культивирования. )жизнеспособность клеток по включению трипанового синего составляет 70-80Х.

Характеристика целевого продукта.

Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом, относятся к 1q С1 подклассу и связывают гемагглютинин цельного вируса гриппа А (Ленинград)

385/80(H3N2) и выделенный с помощью детергента дезинтегрон-О. Взаимодействие антител с гемагглютинином вируса гриппа может быть выявлено способом, при котором гемагглютинин используется в качестве антигена как поверхностный гликопротеин нириона (твердофаэный иммуноферментный анализ) или методом торможения гемагглютинации, использующим МкАТ к гемагглютинину в качестве конкурирующего агента °

Использование штамма АН-РСК-4НЯ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Моноклональные антитела используют в иммуноферментном анализе. Для этого полихлорниниловые

96-луночные платы покрывают препаратом гемагглютинина вируса гриппа А (Ленинград)385/80 (НЗМ2) или вирусными концентратами в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида (ЗФР) в концентрации

30 мкг/мл по 50 мкл на лунку. Спустя

8 ч, лунки промывают в трех сменах

ЗФР н течение 10 мин. В дальнейшем отмывают аналогично. Инкубируют везде при комнатной температуре. Свободные валентности платы насыщают в течение одного часа 17-ным раствором человеческого сывороточного альбумина в

ЗФР, после чего лунки отмывают и добавляют в них культуральную среду от штамма, продуцирующую моноклональное антитело к гемагглютинину вируса гриппа, по 50 мкл на лунку на 1 ч.

Лунки отмывают и инкубируют с кроличьей антисывороткой против иммуноглобулинов мыши, разведенной в 100 раз в ЗФР в течение 1 ч. Избыток антисыворотки-отмывают и добавляют ПАПреагент на 1 ч. ПАП-реагент получают, готовя смесь культуральной среды от гибридомы АР— FC -2В4, продуцирующей моноклональное антитело против пероксидазы хрена, с пероксидазой хрена (конечная концентрация

1479510

50 мкг/мл) . После удаления избытка

ПАП-реагента отмывкой пероксидаэную активность выявляют добавлением окрашиваемого субстрата по 100 мкл на лунку.

Приготовление субстрата. К смеси

5,1 мл 0,2 И Ма 11ГО и 4,4 мл 0,1 И лимонной кислоты добавляют 9,5 мл дистиллированной воды, рН доводят до

5,0 концентрированной ортофосфорной кислотой. В раствор добавляют 0,04Х ортофенилендиамина (Sigma) и 0,05Х перекиси водорода. Положительная реакция проявлялась желто-коричневым окрашиванием. Реакцию останавливают через 20 мин концентрированной серной кислотой (по !О мкл на лунку).

Оптическую плотность в каждой лунке оценивают с помощью oïeêòðaôîòîметра при длине волны 495 нм, В контролях вместо моноклональных антител к гемагглютинину вируса гриппа обработку проводят культуральной средой от миеломной линии с одной стороны и кроличьей сывороткой против вируса гриппа с другой.

Пример 2. Вместо вирусных антигенов на полихлорвиниловую плату адсорбируют кроличью сыворотку против вируса гриппа А (Ленинград) 385/80 (НЗН2), разведенную в 100 раз ЗФР, при комнатной температуре. Спустя

8 ч, ее избыток отмывают, свободные валентности насыщают 1Х вЂ” ным раствором человеческого сывороточного альбумина в ЗФР, лунки отмывают спустя 1 ч и добавляют вирусные антигены и другие компоненты, как описано в примере 1.

Пример 3. Моноклональные антитела к гемагглютинину вируса гриппа используют для торможения гемагглютинации с препаратом гемагглютинина А (Ленинград) 385/80 (НЗИ2) и различными вирусными концентратами в реакции торможения гемагглютинации.

Для постановки реакции торможения гемагглютинации готовят рабочее разведение антигена, в 50 мкл которого содержится 4 агглютинирующие единицы (АЕ) вируса. С этой целью исходный антиген разводят изотоническим раствором (ИР) во столько раз, сколько получается от деления его гемагглютинационного титра на 4.

Перед постановкой основной реакции проверяют, действительно ли в 50 мкл выбранного разведения содержится

4 АЕ. Для этого в 4 лунки разливают по 50 мкл ИР. В первую из них добавляют 50 мкл рабочего разведения антигена, госле смешивания 50 мкл пере5 носят во вторую лунку, из нее — в третью, затем в четвертую. Иэ четвертой лунки 50 мкл жидкости выливают.

После этого в каждую лунку приливают по 50 мкл ИР и по 100 мкл 1Х-ной суспензии эритроцитов курицы. Таким образом, в 1-й лунке содержалось 2 АЕ, во 2-й — 1 AF., В 3-й 0,5 АЕ и в

4-й — 0,25 АЕ. В пятой лунке ставят

15 контроль эритроцитов 100 мкл ИР со

100 мкл 1Х-ной суспензии эритроцитов.

Реакцию оставляют на 45 мин при комнатной температуре (до оседания эритроцитов в контроле).

При правильном выборе рабочей дозы антигена (4 AE) в 1-й и во 2-й лунках наблюдают полную агглютинацию, в 3 — и лунке агглютинация была частичной или отсутствовала, в 4-й лунке

25 5агглютинации не было.

Готовят двукратные разведения моноклональных антител к гемагглютинину, инактивированных при 56 С в течение

30 мин, по 50 мкл на лунку. Количество рядов двукратных разведений моноклональных антител соответствуют количеству антигенов, к которым тестировали моноклональные антитела,.

После того как моноклональные ан35 титела разведены во все лунки наУ чального ряда вносят по 50 мкл рабочего разведения одного иэ антигенов, во все лунки следующего ряда разведений этих же антител по 50 мкл рабо40 чего разведения др. антигена и т.д.

Плату оставляют на 1 ч при комнатной температуре. После этого во все лунки всех рядов вносили по 100 мкл

1Х-ной суспензии эритроцитов и остав45 ляют на 45 мин при комнатной температуре. Титром моноклональных антител считают их последнее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации. В контролях обработку вместо моноклональных антител проводят культуральной средой от миеломной линии и кроличьей сывороткой против вируса гриппа А (Ленинград) 385/80(НЗИ2) °

Результаты реакции торможения гемагглютинации представлены в таблице.

Формула изобретения

111тамм гибридных культивируемых клеток животных Ииз тызсп1пз - BCKK

1479510

Р БСКК(П) 157D — продуцент монокло- ° руса гриппа А (Ленинград) 385/80 нальных антител к гемагглютинину ви (H3N2).

Антиген

Моноклональные

Кул ьт урал ьная среда (от миеломной линии), титр антитела (асцитическая жидкость), титр

16000

1000

4000

2000

Составитель С.Светлышев

Техред M. Ходанич Корректор Л Патай

Редактор М. Недолуженко

Заказ 2504/25 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина,10!

Препарат гемагглютинина вируса гриппа

А (Ленинград)385/80/ (НЗИ2)

Вирус гриппа А (Ленинград)385/80(НЗМ2)

Вирус гриппа А (Чили) 1/83 R <(H1N1)

Вирус гриппа А (Прага) 1/84 (H2N2) Кроличья сыворотка (против вируса гриппа

H3N2), титр