Штамм бактерий bacillus suвтilis-продуцент @ -глюканазы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности , в частности, к получению нового штамма, используемого для получения фермента β-глюканазы, расщепляющего полисахариды с β -1,3/1,4 глюкозидными связями, β-глюканаза может быть использована в пищевой промышленности. С целью повышения β-глюканазной активности в качестве продуцента используют штамм BACILLUS SUBTILIS ВКПМ В-3936, выделенный из почвы на плотную питательную среду, содержащую субстрат лихенин ОЛ-11. Применение предлагаемого штамма позволяет увеличить ферментативную активность на 100%. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ. НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbITHRM

flPH ГКНТ СССР

1 (21) 4275264/28-13 (22) 05.06.87 (46) 15.09.89. Бюл. Р 34 (71) Научно-производственное объединение "Фермент" (72) О,В.П.Тряпшене, В.Ю,Авиженис и Т.IÎ.Ïàäåãèìañ (53) 577.15 (088.8) (56) Авиженис В.Ю. Изучение возмож" ности создания мультиэнзимной композиции (M3K-1) для стабилизации вин.

-ИПЭ 05-83, инв.Р 02830053383, НПО

"Фермент", Вильнюс, 1984, с.1-66.

Белогорцев Ю.А., Чернягина Т.Б. и Быкова О.Н. Условия выделения зндо -глюканазы из культуральной жидкости

Bacillus subtilis. -Микробиологическая промышленность, 1977, вып.4, с.17-19.

Изобретение относится к микробиологической промьппленности, в частности, к получению нового штамма, используемого для получения фермента р-глюканазы, расщепляющего полисахариды с -1,3/1,4 глюкозидными связями, р-глюканаза может быть использована в пищевой промышленности.

Цель изобретения — получение нового штамма продуцента р-глюканазы с более высокой ферментативной активностью. штамм Bacillus subtilis (Т-86)

ВКПМ В-3936 выделен иэ почвы при поиске и отборе продуцентов р-глюканазы на плотной питательной среде со специфичным субс-.ðàòîì — лихенином.

Основным критерием отбора являлись прозрачные зоны вокруг колонии, воз-, „„Я0„„1507793 А1 (51)4 С 12 N 9/42//(С 12 N 9/42, С 12 R 1:125) 2 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS — ПРОДУЦЕНТ / -ГЛЮКАНАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению нового штамма, используемого для получения фермента р-глюканазы, расщепляющего полисахариды с p — 1,3/1,4 глюкоэидными связями, -глюканаза может быть использована в пищевой промьппленности. С целью повышения р-глюканазной активности в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis ВКПМ

В-3936, выделенный из почвы на плотную питательную среду, содержащую субстрат лихенин ОЛ-11. Применение предлагаемого штамма позволяет увеличить ферментативную активностЬ на

1002. 1 табл. никшие.при гидролизе окрашейного субстрата во время роста исследуемых микроорганизмов. Дальнейшее исследование ферментативной споСобности отоб- е Д ранных продуцентов при глубинном их культивировании показало, что наиболее фф высокой р-глюканазной активностью обладает штамм В.subtilis Т-86, который имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки.

Клетки культуры имеют форму палочки размером 0,5-0,75 2,5-3,0 мкм. Выащенные на богатой питательной среде клетки имеют вид толстых палочек, иногда расположенных в цепочках. Клетки культуры грам-положительные, беэ капсул, подвижные с помощью перитрихальных жгутиков. Споры цилиндрические или зллипсоидные, прорастание спор

3 150779 экваториальное путем разрыва мембраны вдоль экватора.

Культурально-физиологические признаки.

На мясопептонном агаре после 24-

5 часовой инкубации при 37 С колонии диаметром 2-? мм. Колонии íà МПА с гладкими краями, непрозрачные с выраженным центром. На ломтике картофеля рост обильный, пленка сухая, толстая, морщинистая, серовато-белого цвета.

Культура — строгий аэроб с оптимальной температурой роста 37 С при рН

6,2-6,6. При росте усваивает глюкозу, лактоэу, сахарозу, декстрозу и маннит с образованием кислоты, углеводы— ксилозу, мальтозу, дульцит, адонит, гидролизует с образованием щелочи. 20

Нитраты восстанавливает до нитритов.

Гидролиэует крахмал, разжижает желатину, пептонизирует молоко ° На среде

Кларка не образует ацетилметилкарбинол, 25

Культура поддерживается на ломтиках картофеля и хранится в консервированном виде (на ломтиках картофеля в пробирках, лишенных кислорода, а также в лиофилизированном виде) .

Пример 1. Получение культурапьной жидкости в колбах.

Для глубинного выращивания штамма

В.subtilis Т-86 используют питательную среду следующего состава, г/л:

Нерастворимый крахмал 239,00

Кукурузный экстракт 11;40

Дрожжи пивные 2,20

Лактоза 0,60

Аммоний Фосфорнокислый 2-зам. 8,40

Медь сернокислая 0,0036

Натрий хлористый 0,28

Магний сернокислый 0,15

Калий сернокислый 2,90

Кальций хлористый 0,45

Среду готовят в несколько этапов.

Осахаривание крахмала.

Для получения 1 л среды 239 r нерастворимого крахмала заливают 530 мл

50 воды, перемешивают и добавляют 0,9 r бактериальной амилазы, подогревают на водяной бане до 85 С и выдерживают при перемешивании 30 мин, далее температуру поддерживают 100 С в тече55 ние 1 ч, охлаждают. Качество осахаривания проверяют с йодом, который не должен дать синего окрашивания.

3 4

Приготовление раствора основных компонентов среды.

В 137 мл воды растворяют остальные компоненты среды кроме фосфата аммония, прибавляют осахаренный крахмал, перемешивают, рН доводят NaOH или Н,РО до 7,0, проверяют объем, который должен быть 667 мл (при необходимости прибавляют воду) и разливают по 34 мл в колбы емкостью

750 мл стерилизуют при 125 С в течение

30 мин.

Приготовление раствора фосфатов.

В 333 мл подогретой до 60 С воды растворяют 8,4 аммония фосфорнокислого 2-зам. Раствор разливают по 16,5мл в пробирки и стерилизуют при 125 С в течение 30 мин.

Перед засевом в стерильных условиях к каждой колбе прибавляют 16,5 мл раствора фосфатов и среду засевают односуточной культурой В.subtilis

Т-86. Выращивание проводят при 37 С на качалке с 180 об/мин. На 72-м часу роста определяют а-глюканазную активность (по определению восстанавливающих сахаров с применением реактива

ДНСК) при рН 6,5 и 30 С,используя субстрат — лихенин, которая составляла 20 ед/мл.

Пример 2. Получение. культуральной жидкости в бродильных установках.

Культивирование штамма Б.subtilis.

Т-86 проводят в бродильных установках типа "Биолафит" с 10 л питательной среды, полученной по примеру 1. Ферментацию производят с подачей воздуха

6 л/мин и перемешиванием среды 240 об/мин. Для пеногашения используют синтетический пеногаситель АС-60 пропинол (0,1X). Ферментацию прерывают после 48 ч культивирования, так как в данный момент, питательная среда уже истощается углеводами и в культуральной жидкости определяют р- глюканазную активность.

Результаты испытания нового штам а

В.subtilis T-86 — продуцента р-глюканаэы и прототипа В.subtilis, 402 приве-. дены в таблице.

У прототипа за единицу активности принимается такое количество фермента, под действием которого за 20 мин гид- ролиза при температуре 30 С образуется 1 мг редуцирующих веществ в пересчете на глюкозу, а у предлагаемого штамма — количество фермента, под

5 15077 действием которого за 1 мин гидролиза при 30 С образуется такое количество редуцирующих веществ, которое соотвествует 1 мкМ глюкозы (О, 18 мг) . Для

5 сравнения единицы активности у прототипа были перечислены на единицы активности предлагаемого штамма.

Иэ таблицы видно, что при использовании штамма В.subtilis Т-86 р -глю- 1О каназная активность культуральной жидкости в 2 раза выше, чем В.subtilis

402.

Применение предлагаемого штамма для получения р-глюканазы позволит увеличить ферментативную активность на 100%.

93 6

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis

BKIIM В-3936 — продуцент р-глюканазы.

Активность, ед7мп, при культивировании

« в колбах в биолафитах

Продуцент

В.subtilis

Т-86

41 6

20 2

В ° subtil is

402

I5

9,7

Составитель В.Соина

Редактор Л.Пчолинская Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н.Борисова

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101

Заказ 5516/29 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного кбмитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР!

13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5