Рекомбинантная плазмидная днк р7,5s 11сме, обеспечивающая одновременную экспрессию антигенов вирусов клещевого энцефалита и гепатита в, и способ ее конструирования

 

Изобретение относится к геиетимеской инженерии и биотехнологии, а именно к получению рекомбинантных антигенов вирусов клещевого энцефалита (КЭ) и гепатита В на основе вируса осповакцины (ВОВ). Рекомбинантная плазмидная ДНК p7,5S llCflE состо: ит из фрагмента генома вируса КЭ, фрагмента генома вируса гепатита В, промоторов ВОВ и плазмидного вектора, обеспечиваюсиего встройку указанных, компонентов в ТК-ген ВОВ. В Кгтместпп фрагмента генома вируса КЭ используют фрагмент ДНК длиной 1775 п.о. , кодирующий комплекс генов С, М, Е. В качестве фрагмента генома вируса гепатита В используют фрагмент вирусной ДНК, содержа1чий ген HBsAg. П качестве СИЛЬНОГО промотора для экспрессии генов ВКЭ используют 11к промотор 80В, а в качестве плазмидного вектора, обеспечивающего интеграцию ДНК вирусов КЭ и гепатита В в состав гена тимидинкиназы ВОВ, а также для экспрессии гена HBsAg под контролем 7 5к промотора ВОВ используется плазмида pVAR 15. Рекомбинантные вирусы осповакцины , полученные на основе указанных компонентов, экспрессируют полипептиды, которые вызывают образование у животных антител, связывающихся с основными белками оболочки вирусов гепатита В и клещевого энцефалита. Q « сл сл сл О5 CD О5

(51)5 С 12 N 15/00 т

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

tJ1 рт «».".. 1",, ;; . ЭЗСЗ COBF1CHHX ..-.(iт3 -; " )" 3 сОциАлистических

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (46) 07. 07.93. Бюл. t" 25 (21) 4305365/13 (22) 11.09.87 (71) Всесоюзный научно -исследователь-, ский институт молекулярной биологии и Новосибирский институт биоорганической химии СО AM СССР (72) А.С.Беляев, И.П.Дмитриев, Н.И.Путинцева, Л.P.Ïåâëÿãèíà, М.М.Бакланов, А.Д.Аммосов, Е.F.Ìèðî" нова, A.Г.Плетнев, E..К.Прессман и Л.Э.Матвеев (56) poaletti Е. et Il. Antiviral

research, 1985, Suppl . 1, 301-308. (54) РЕ! ОМБИНАНТНАЯ ПЛАЭМИДНАЯ ДНК р7,5S ПСИК, ОБЕСПЕЧИВАЛ АЯ ОДНОВРЕМЕННУЮ ЭКСПРЕССИИ АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ

КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА И ГЕПАТИТА В, И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии, а именно к получению рекомбинантных антигенов вирусов клещевого энцефалита (КЭ) и гепатита В на основе вируса осповакцины (ВОВ). Рекомбинантная плаэмидная ДНК р7,5S ПП1Е состо-, Изобретение относится к генетичес кой инженерии и биотехнологии, а ; именно к получению рекомбинантных антигенов вирусов клещевого энцефалита и гепатита В на основе вируса осло вакцины.

Целью изобретения является создание рекомбинантной плаэмидной ДНК, содержащей одновременно комплекс

„„SU „„151 568!) ит иэ фрагмента генома вируса КЭ, фрагмента генома вируса гепатита В, промоторов ВОВ и плазмидного вектора, обеспечивающего встройку указанных компонентов в ТК-ген ВОВ. В качестве фрагмента генома вируса КЭ используют фрагмент ДНК длиной 1775 п.о., кодирующий комплекс генов С, M, F.. В качестве фрагмента генома вируса гепатита В используют фрагмент вирусной

ДНК, содержащий ген HBsAg. В качестве сильного промотора для экспрессии генов ВК3 используют 11к промотор ВОВ, а в качестве плазмидного вектора, обеспечивающего интеграцию ДНК вирусов КЭ и гепатита В в состав гена С2 тимидинкинаэы ВОВ, а также для экспрессии гена HBsAg под контролем 7, бк проиотора BAG испопизуетсл плазиида pVAR 15. Рекоибииаитиые вирусы ос- С повакцины, полученные на основе укаэанных компонентов, экспрессируют полипептиды, которые вызывают образова" ние у животных антител, связывающихся с основными белками оболочки вирусов гепатита В и клещевого энцефалита. структурных генов вируса клещевого энцефалита и ген 11BsAg вируса гепатита В и обеспечивающей при встройке в ТК-ген вируса осповакцины одновременную экспрессию кодируемых ими антигенных полипептидов в клетках млекопитающих и организмах животных.

Сконструирована рекомбинантная плаэмидная ДИК р7,5S 11СИЕ, обеспеl 515696 чивающей синтез антигенов вирусов клещевого энцефалита и гепатита В, которая состоит из фрагмента генома вируса клещевого энцефалита, фрагмента генома вируса гепатита В, промоторов вируса осповакцины, нлазмидного вектора, обеспечивающего встройку указанных компонентов в ген тимидинкинаэы вируса осповакцины. l0

Пример 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК р7 5S IICNE °

50 мкг ДНК плазмиды р", содержащей фрагмент ДНК вируса гепатита В, кодирующий HBsAgp, расщепляют XhoI u

Bam HI — рестриктазами в реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис-НС1, рН 7,9, 10 мМ Г1ВС1 ; 7 мМ р -меркаптоэтанол, по 200 ед. XhoI и ВапН1 - ре- 20 стриктаз. Инкубацию осуществляют при

37 С в течение 1 ч. XhoI — BamHI фрагмент длиной 1273 п.о., содержащий ген HBsAg, выделяют после электрофо-. реза методом электроэлюции на диализ- 2э ную мембрану. Полученный фрагмент лигируют с EcoRI, SalGI синтетическим фрагментом ДНК, имеющим следующую структуру:.

ААТТСТССАССАТССС 30

GACGTCCTAGGCAGCT

Так как Sal GI u XhoI-рестриктаэы имеют одинаковые липкие концы, то пришивка линкера происходит к SalGI— концу фрагмента 1273 п.о. Гидролиз продуктов сшивки по внутреннему

Ва»НП-сайту линкера приводит к обра" зованию Вап>Н1 фрагмента ДНК длиной

1279 п.о., содержащему ген HBsAg

Этот фрагмент кпонируют по Вап>Н1"сай- 40 ту в плазмиде pBR 322 и полученную таким образом плаэмиду обозначают р4.

Из плазмиды р4 выделяют Вап>Н1— фрагмент длиной 1279 п.о. и клонируют его а векторе р VAR 15. 4

Клоны, содержащие искомый фрагмент, идентифицируют методом ДНКДНК гибридизации, ориентацию Фрагмен та определяют путем ХЬа 1 — гидропиза положительных по гибридизации клонов.

Плазмиду, содержащую фрагмент 1279 п.о. е правильной ориентации относительно 7,5к промотора вектора р VAR

15 обозначили р7,5S.

Плазмиду р7,5В гидропизуют в условиях неполного гидролиэа в реакционной смеси, содержащей 100 мкг/мл ДНК ппазмиды р7,5S, 10 мМ трис-НС1 рН

7,5, 10 мМ МВС1:, 7 мМ р-л<еркаг>тоэта-. нола, 30 ед/мп Ва»>111-рестриктазы, Реакцию ведут при 37 С 15 мин, после чего действие Ка»>Н1-рестриктазь> остао навпивают прогреванием пробы при 67 С

15 мин, добавляют НаС1 до концентрации 100 мМ и FcoRI-рестриктаэу до концентрации 200 ед/мл. Реакцию расщепления ДНК СсоЕ1-рестриктазой проводят при 37"С в течение 1 ч, после чего выделяют Ва»>Н1-BcoRI — Фрагмент

ДНК длиной 5723 п.о., соответствующий по электрофоретической подвижности в

0,73 агароэном геле линейной Форме плаэмиды р7,5S.

Из плаэмиды р 311 выделяют BamHIFcoR1 — фрагмент ДНК длиной 2682 п,o., содержащий С, М, Е гены вируса кпещевого энцефалита, состыкованные с 11 к промотором и клонируют его в Bam HI—

FcoRI линеаризованной плазмиде р7,5S.

Клон, содержащий в составе вектора рЧАР 15 как ген HBsAg (Ваи>1П фрагмент

1279 п.о.), так и состыкованные с

11к промотором С, M, E гены (BamHI—

FcoRT фрагмент 2682 п.о.) обозначили р7,5S 11СМЕ.

ДНК ппазмиды р7,5S 11СИЕ используют для трансформации клеток почек зеленой мартышки СУ-1, зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИПВ. Урожай вируса после трансформации высевают на монослой перевиваемой линии клеток

Н143ТК, В присутствии 25 мкг/мл бром" дезоксиуридина отбирают вирусные клоны, методом jlHi(-ДНК гибридизации на фильтрах, проверяют наличие последовательностей ДНК вирусов клещевого энцефалита и гепатита В в клонах. Положительные по гибридизации клоны наращивают на клетках СУ-1 на среде

Игла МЕМ с 2>, сыворотки новорожденных телят. В пробах, содержащих клеточные лизаты и культураг>ьные жидкости, определяют наличие антигена вируса клещевого энцефалита иммуноферментным методом с пероксидаэой хрена, а наличие НВэЛГ радиоиммунопогическим сэндвич-анализом.

Во всех опытных пробах был обнаружен антиген вируса клещеоого энцефалита в концентрации 30-60 нг/мл и

HBsAg в концентрации 100-300 нг/мл.

Кроликов шиншипл массой 1,5"2 кг иммунизируют nocp äcòâoì скарификации в область спины 1 мл клеточного лиза" та, содержащего реконбинатный вирус оспооакцинь> в титре 10 . Перед нача>> лом иммунизации у 3,»åoòíûõ берут кровь

5 1515696 6 и проверяют наличие неспецифического содержац!ий ген ампициплинреэис" -н связывания с антигенаии вирусов кле- ности и участок инициаци< ге .

Образцы крови иммунизированных жи- вируса осповакцины размспом 76/ п,o., 5 вотных забирают каждые 2 недели по кодирующий !ности иеченого I протеина А после са гепатита В размерол 1273 п.о,, копоследовательной инкубации сыворотки дирующий S-белок вируса гепатита B, и затем иеченого протеина А на план- -BamH I — Cla I фрагмент ДНК плэ:-шете с нанесенным антигеном. миды pBR322 размером 35? п.о., Аналогичным образом проводят тес- 2<1 -Cla I — ЕсoR 1 фрагмент ДН1< виру" тирование антител против вируса осло- са осповакцины размером 546 п,o, i-пвакцины, однако в этом случае в ка- держащий II к проиотор, честве антигена вместо lfBshg исполь- -EooR I — Fok 1 синтетическийфрагзуют вирус осповакцины. мент ЛНК разиером 9 п.о., Антитела к антигену вируса клеще- 25 -Fok I — FcoR 1 фрагмент Д11К вого энцефалита определяют методом 1775 п.о., кодирующий структурные

"до -blotting в системе трехслой" белки вируса клещевого энцефалита, ного "сэндвича" с использованием в -Fcc R I — Hind I I фра гмент Д! !К янкачестве антигена высокоочищенного руса осповакцины раз леролл 10/1 n,о., белка оболочки вируса КЭ, сорбирован- 30 кодирующий С-концеву l часть 1I Ht<, 1инного на нитроцеллюлоэных фильтрах, киназы вируса осповакцины, выявление специфических антител про- -уникальные сайты рестр.",кции; изводят с помощью маркированного пер- Ват!! I, Есо R I, Pst I, !find 171, оксидаэой протеина А. Из 5 иммуниэи- Xbo I, SalG I; рованных кроликов у 4 кроликов проис- З5 -генетические маркерь: г;эл<,:д..: г ходила индукция антител против вируса а < p — устойчивость к ампицилпчну. осповакцины, при этом у двух кропи- . 2. Способ конструиропэн.п р, кд,- иков из четырех образовывались анти- нантной плазмидной ДНК p/,5". 11<;;1 тела против антигена вируса кпецево- заклю <ающийся в том, что к Л-о го энцефалита в титрах 1/160 и 1/160- 4р Ва<п!! I фрагменту /1НК пиру а;,;;ати1/320, и у 1 кролика - индукция анти- та В, содержацему ген fii):-. -,, 1; н:.. пател против HBshg вируса гепатита Б JOT S» (1 — 11ап1! 1 линк;<, гг, в титре 1/200. 1Bshg в составс образов.. .< а и

Такии образом в изобретении впер- Вагл1! I — Вам! I фрагменго t -tn :;.".;.г вые осуществлена экспрессия генов ви- 45 no B» .f -сайту в г

>< <НК . миду р7, "Я гидроло<з\ ют и непопногп гидролиз,t 1!и-,,1! J формула и зобрет ения 50тазой, а зателлЕ<11)

1. реко<лбинантная плаэмидная ДНК и к B.<г<1! I — ЕсоК I пи< р7,5S II C!11 ., об.спечива:зал одновре- n»as u<ëü р7,5S пои -п-, ионную экспрессию антигенов вирусов EcoR I фрагмент паза< ..<; клещевого энцефалита и гепатита В, яерж щи-< структуР<":.. г, i мол.м. 5,24 М и размером - 8411 п.о., вв РУса " :""-"- пого ."-"" : содержащая: леи I i v. про<лр го Рп, и

-!find III — Р<«< 1 I фрагмент ДНК вую Р .< .. Йил<антнуt..

/ 1 плазм«ды pBR322 р; зл<е 1.<..<л 23 26 и. о., 11С ;;.