Способ определения количества х-хромосом человека

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1494

А1 (51)5 G 01 Б 33/60 С 12 ) 1 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Цель изобретения — ускорение и повышение точности способа.

Сущность изобретения заключается в том, что клонированный фрагмент альфа-сателлитной ДНК человека, специфически маркирующий Х-хромосому, используется в качестве ДНК-зонда для дифференциального выявления X-хромо-.. сом в интерфаэных ядрах или метафаэ-. ,ных клетках человека, позволяя быст-

pq и надежно определять число Х хро4 мосом на цитологических препаратах клеток человека в условиях in situ, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (46) 07.01,91 Бюл. )1- 1 (21) 42577) 3/14 (22) 05.06.87 (71) Институт клинической психиатрии

Всесоюзного научного центра психического здоровья АМН СССР (72) Ю.Б. Юров, И.А. Александров, С.II. Миткевич и С.Г. Ворсанова (53) 612.015(088.8) (56) Генетика, 1984, т, 20, II» 11, с . 1 749-1762, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА

Х-ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к медицинской генетике и может быть использовано для от»ределения числа

Х-хромосом в ранней пренатальной диагностике на материале биопсии хорина в первом триместре беременности и постнатальной диагностике на материале некультивируемых клеток периферической крови человека наследственных болезней, сцепленных с полом и связанных с численными

Изобретение относится к медицинской генетике, в частности к области медико-генетического консультирова- ) нин и пренатальной диагностики наследственных болезней, сцепленных с полом, и связанных с численными на" рушениями в системе половых Х-хромосом, и может быть использовано для ранней экспресс-диагностики на материале биопсии хориона человека в первом триместре беременности или на материале периферической крови человека беэ культивирования клеток.

2 наруптениям»» в системе Х-хромосом (синдромы Клайнфельтера, Тернера, трипло-X) . Цель — ускорение н повышение точност»» способа. Сущность иэобрете»»ил заключается в том, что клонированный фрагмент альфа-сателлитной ДНК человека используется в качестве ДИК-зонда для выявления

Х-хромосом в интерфаэных ядрах, позволяя в течение 2-3 дней определить число Х-хромосом на цитологических препаратах клеток человека при проведении гибридизации в следующих условиях: температура гибо ридизации 42 С, продолжительность гибридизации 18 ч, состав раствора для гибридизации 50Х формамида, I0X декстрансульфата 500; 0,15 М хлористого натрия, 0,015 М цитрата натрия и радиоактивной ДНК-зонда в концентрации 0,5 >IО импульсов в 1 мин в расчете на 20 мкл гибридизационной смеси.

1494724

Источником выделения маркер»ого фрагмента альфа-сателлит»ой ДНК (проба рУАМ 10/40A) служит тотальная

ДНК человека, выделенная стандартным иетодом иэ »!э»еток плаценты. Препарат

ДНК человека обрабатывают рестриктазой Pst I до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшивают" с помощью лигирования в сайт IO

Pst I плазмидного вектора pUC19 (pasмерои 2688 пар нуклеотидов) . Полученной после лигирования смесью, содержащей встроенные в плазмиду фрагменты геномной ДНК человека, трансформируют!5 бактериальные клетки F.coli штамм

ВМН 71/17. Бактериальные клетки после трансформации высевают на селективную среду Мак-Конки (фирма Дифко) длл выращивания бактерий, позволяющей отбирать трансформированные клетки, содержащие плазмидную ДНК со вставкой ДНК человека. Это обусловлено тем, что плаэмида pUC19 содержит сайт Pst Т

25 в районе гена синтеза -галактозидазы, который инактивируется в результате встройки любого фрагмента

ДНК в этот сайт.

Таким образом, на селективной среде бактериальные колонии, содержащие плаэмиды со вставкой ДНК человека, окрашиваются в белый цвет, а колонии без рекомбинантных плазмид — в красный. Следовательно, данный вектор позволяет создать рекомбинянтную кло- 35 нотеку и отобрать клоны бактериальных клеток, содержащих встроенные в них фрагменты ДНК человека.

Для отбора бактер»альных клонов, содержащих плазмиды с альфа-сател- 40 литной Д1!К человека, проводят гибридизацию колоний »а нитроцеллюлоэных фильтрах с меченной Р-ДИК альфоидной ДНК человека размером 340 пар нуклеотидов,который клонирован, сек- 45 венирован и отнесен к альфа-сятеллитной ДНК. Колонии, которые дают положительный сигнал на рад»оавтографях в результате гибридизации, отбирают и используют для определения хромосом- 50 ной локализации клонированных рестриктных фрагментов ДНК непосредственно в цитологических препаратах хроиосом.

Получение .цитологи песк»»х пре»»Лря- 55 тон и»»терфа э»тык и метяфаз»»ь»х клеток, меченных тр» т т»ем образ»»ов Д!!К, и гибрндиз я»ит чет» е»нь»х рядиоя к TF»»» ныи т»ред»т»Г т. 1 т«ч»»»»к я мтт peênèá»»»»;» т(т! » тх молекул !П!К п условиях i u s i tu, проводят, как описано в примере °

Пример I . Тотальную ДНК че- ловека выдел»»ли из клеток плаценты, Раэмельче»»ую механически ткань помещали в ?-3-крат»ый объем 0,05 M буфера трис-НС1 pll 9,0 и размельча. ли до получения клеточной суспензии ,в гомоген»»заторе в течение 10 с.

К суспенэ»и клеток добавляли лизирующий раствор додецилсульфата натрия до конечной концентрации !7.

Раствор прогревали в течение !О мин о при 60 С, а затем проводили фенольную и хлороформную депроте»»»»»»зяц»»ю.

ДНК из раствора (водной фазы) осаждают равным объемом»»эопропилового спирта в течение ч при — 8 С. о

Осадок раст»торлют в буфере TL (50 мМ трис-НС1, pll 8, О, 5 мМ ЭДТА), содержащем 17-ный раствор додецилсульфата ня.тр»л (SDS) . Длл удаления ос таточ»ых белков препарат обрабатывают протеи»азой К (100 мкг/мл) в о тече»ие 2 ч при 37 С, а зятем повторно проводят фенольную и хлороформную экстракцию, как описано вышее. Препарат ДНК осаждают равным объемом »зопропилового спирта, высушивают, растворяют в буфере ТЕ в концентрации от I до 5 мг/мл. Для удаления из препарата РНК, раствор ".нкубируют в течение 2 ч при 37 С с РНКазой в концентрации 100 мгlмл. Затем проводят фенольную и хлороформную депротеиниэяцию, осаждение ДНК изопропиловым спиртом, как описано выше.ДНК растворяют в буфере ТЕ и определяют конце»»трацито ДНК с помощью спектрофотометра при волне 260 нм.

ДНК рекомбинацтныхплазмид длл по.т»уче»»ия ге»»от»т»от» клот»отеки и для скрипни»га бактериаль»ых колоний вы-, деляют из !00 мл ночной культуры, выращивая бактерии на среде LB (l0 r/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaC1 с добавлением ампициллина до концентрации 100 мгlмл).

Бактериальные клетки иэ водной фазы осаждают 2,5 объемами этилового спирта. Образцы ДНК растворяют в буфере TE и используют для лигирования и получения геномной кдонотеки» как описано н»же.

Компетентную культуру бактерий штамма ВМН 71/17 готовят следующим образом: в 25 ил питательной среды

1.В вносят I мл ночной культуры F cnl i

1494 724 6

Выдь!эжин ают ч при 0 С . Ос едок по лучsaxr нептрифугиронанисм н течение

20 мин при 14 00 o6/ìèí (ротор

Бекман 2-21).. Надосадочную жидкость, содержащую плэзмидную ДИК, смешивают с ранным объсмом хлороформиэоамилоного спирта (смесь н соотношении 24:1), энергично встряхивают и центрифугируют н течение 5 мин при

2000 об/мин (ротор Бекман l. 7,5) .

Отбирают водную фазу и плазмидю ую

ДНК осаждают Равным объемом изоамилоного спирта н течение 1 ч при о !

5 -18 С. Осадок собирают центрифугированием н течение 10 мнн при 5000 об/

/мин (ротор Бекман M-7,5) и растворяют в воде. Затем ДНК персосаждают иэ водного раствора 2,5 объемами

20 этилового спирта в течение 1 ч при о

-18 С. Осадок собирают центрифугиронанием, промывают дважды 70 -ным этилоным спиртом, высушивают и растворяют н 200 мкл буфера ТЕ.

25 и выращивают на качалке дo мутности

А „= 0,4-0,5. Деление клеток останавливают., помещая культуру на лед на 10-! 5 мин, с последующим центрифугиронанием н течение 10 мин при

5000 об/мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного о до О С раствора 100 мМ СаС1 клетки осаждают и ресуспендируют в 12 кп

1 00 мМ СаС1 . Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М СаС1 с 157 глицерином. После инкубации полученной суспензии при О С н течение 30 мин, культура готова к трансформации.

Культуру хранят при -80 С.

К 200 мкл компетентной культуры бактерий при 0 С добавляют 0,1—

0,2 мкг лигированной ДНК и инкубируют при этой же температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню с температурой

О

42 С на 60-90 с и cHDBR помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют до 1,5-2 мл жидкую питательную среду ЬВ и подращинают на ка чалке 2 ч при 37 С. Трансформированные клетки нысеивают на селективную среду Мак-Конки (по О,I ип культуры на чашку Петри со средой в 1,5X araре) с добавлением ампициллина.

Для идентификации колоний бактерий, содержащих плазмиды со вставками ДНК человека, и окрашенных в белый цвет, их наносят репликой на нитроцеллюлозные фильтры, находящиеся на поверхности чашек Петри с твердой питательной средой ЬВ. Выросшие в течение суток при 37 С бактерии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 Н

Na0H и оставляют на 5-10 мин. Подсушив, осаждали из 100 мл ночной культуры в течение IO мип при

6000 об/мин центрифугиронапием.Осажденные клетки ресуспендировали в

IО мл буфера, содержащего 50 MM глюкозы, 25 мМ ЭДТА, 25 мИ трис-НС1, РН 8,0 и 2 мг/мл лизоцима..После

15-минутной инкубации при комнатной температуре добавляют 20 мл свежеприготовленного раствора 0,2 H NaOH и 1Х-ный додецилсульфат натрия. После тщательного перемешинания и 5 мин инкубации при 0 С добавляют, l5 мл раствора 3 И ацетата натрия, рН 4,8, тщательно перемешивают и

Эндонуклеаэиую обработку Д!!К челон ека и бактериальной пла амиды

pUCI 9 проводят н буфере, содержащем

1О мМ трис-НС1, рН 8,0 IO мИ NaC1, 30 10 мМ МдС11 и I М дитиотреитола.

Время полного гидролпза рестрик газой Рst 1 н концентрации 5 «д/мкг

llHK составляет 4 ч н случае плазмидной ДНК и 18 ч в случае ДНК человека.

Реакция останавливается добавлением

Равного объема фенола. После фенольной и хлороформной депротеинизации водная фаза трижды промывается водонасыщенным эфиром, и ДНК фильтр с

4р нижней стороны фильтровальной бумагой, дважды по 10 мин его обрабатывают раствором I M трис-НС1, рН 8,0, saтем 1,5 И раствором NaC1 с 1 М трисНС1, РН 8,0 в течение 10 мин. Высу"

45 шенный фильтр помещают н раствор

2SSC с протеиназой К в концентрации

50-100 мкгlмл и инкубируют в нем при

37 С в течение I часа. Далее фильтр промывают в 0,3 М ЬаС1, а затем высу-.

5р шивают под вакуумом 80 С в течение

2 ч.

Образцы ДНК для гибридизации на фильтрах с колониями или на хромосомах 1п situ метят изотопной меткой методом замещения: в 190 мкл воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буфера (0,8 М трисНС1, рН 7 4; О l М MERCI, 0,05 И дитиотрейтола), 5 мкл нерадиоактив—

1494724 титх де:токсинуклеозидтрифосфятов (по

0,02 !! каждого), 5 мкл ДНКязы 1 (концентрация I мкг/мл), 5 мкл ДИКполимераэы 1 (ко»центрация 0,5—

2 ед/мкл), 10 мкл меченного тритием (для гибридизации in situ) или фосфором (гибридизация колоний) одного из деэоксинуклеоэидтрифосфата и Bn-! ды до конечного дбъелта 1 50 мкл . Реакцию ведут в течение 20-40 мин при

20 С. Средняя удельная радиоактивность составляет около 2,5л10 импульсов в I мин в расчете на 1 мкм Д11К в случае трития и около 2,5 10" им- 15 пульсов в 1 мин в случае фосфора (э p) .

Перед гибридизацией фильтр с колоо ниями бактерий вымачивают при 67 С в растворе 6xSSC; 0,5X SDS 0,1% 20 фиколл-400» 0,1% полифенилпирролидон в течение 60-90 мин. Вслед эа этим фильтр насухо промакают фильтровяльной бумагой и помещают в 5 мл гибридизационной смеси, содержащей

6"БИС, О,IX SDS, IOX декстрансульфата-500, 50 мкг/лтл поли-А и денатурирован»ую Р-пробу с суммарной активностью 1 -5тl0 »Mn/ìè». Гибридизацию ь проводят пр» 67 С в течение 18 ч .

Фильтры промывают в нескольких сменах 2 SSC с О,l SDS при комнатной температуре и течентте 20 мин, а затем при 42 С в 0,1.ЯБС и О,IX SDS в течение 15 мин. Фильтры высушивают 35 и помещатот в кассету с рентгеновской пленкой РИ-I Iерез 24 ч экспозиции пленку »роявляют и рядттоавтогряфически идетттттфттцттрут«ч гнбридттые клоны по Hsëè÷èþ положитель»ых сигналов 40 (засвечивание т1тотоэлтульсии пр» контакте с участками г»бридиэяц»» P-меченной ДИК).

Предлагаемым способом ставят опыт с клонотекой из раэлттчттьтх фрагментов 45

Pst I ДНК человека. Нр» этом в качестве зонда длтт гибрид»зации ня колониях берется проба альфоилной Я!К человека, препарат»в»о »ыделенняя иэ состава клонировятгного " «P 1-ф1таг-. .меня а альфоидиой ДНК (Юров, Икот<лев, Зайцев и др. 1986) . В укяэя»»ый образец альфо»дной ДНК вводится изотоп— няя метка ттредлягяелтттм ".>< < înnì зя— мещения. После г»бр»д»з <п»» »я колониях особенно четко обття!тут<,"ттттяется сит пал ня нескольких колон»ях, одна из которых получила ття.тв тт»е р YAM ! О/4ОЛ, соответственно ее тто!<ттдк<тно-му номеру в»гходттой клонотеке. Реколтб»на тня я пля.тмидя р YAM I О/40A для специфического маркирования хромосомы Х человека состоит иэ фрагмента Pst I векторной плязмиды размером 2,7 тыс.п.н. и фрагмента Pst I хромосомной ДНК человека размером

2,0 тыс.п.н.

Препараты хромосом для гибридизатцти ln situ готовят из культивируемых лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитагемягглютинина (фирма "ДИФКО", СШЛ) . Культивирование проводят в пенициллиновьгх флаконах в среде Игла с добавлен»ем до !ОХ сыворотки крупного рогатого скота в течение 72 ч .Затем добавляют колхицин до конечной кон-, центрации 0,20 мкгlмл. Клетки в сре де культивирования переносят н цент» рифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,075 М КС1 и инкубируют. в о течение 15 мин при 37 С. Фиксацию клеток проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:)) трижды по 20 мин. Клетки раскапываются на предметные стекла и высушивают на воздухе.

Гибридизацию in situ меченно1т радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК р YAM 1 0/40А проводят с предварительной денатурацией метафаэных и ттнтерфазных хромосом в течение 30 с в 0,07 Н NaOH с последующим промьпзанием препаратов по 5 мин в 70 и 96 -ном этаноле. Препараты радиоактивно меченных рекомбипантных плаэмид денатурируют нагреванием при

100 С в течение 10 мин в гибридизацио»ной смеси, содержащей 50% формамида, 2 SSC, IOX декстрансульфата500 и до 1-2 10 имп/мин. радиоактивной ДНК. Гибридизацию проводят при 42 С в течение 18 ч. Препараты после гибридизации промывают в 4 сменах 2 SSC при 37 С по 5 мин в каждой смене, затем в 70 и 96 -иом спирте по 5 мин и высушивают на воздухе. Препараты покрывают фотоэмульсией типа M и экспонируют в темноте

1-3 дня. После проявления стандарт ным фотопроявителем препараты окраиптвают красителем Гимэа. Радиоавтографы хромосом анализируют и фотогряфирунт при твеличении микроскогя 250", 1494724

Гибридиза11ин 1и sitU на метнЯ>азн1!х хромосомах иоказь1вает, что w»oU»рпванный фрагмент р УЛ11 10/40Л локали- зуется только в прицентргмерном рай5 оие хромосомы Х и специфически маркирует даннун хромосому.

Пример 2. Применение рекомбинантной плязмиды р YAH 1 О/40Л для определения числа хромосом Х в мета- !О фазных и интерфазных клетках индивидов мужского пола (кариотип 46, XY) . женского пола с нормальным кар»птипом (46, XX) индивида с мозаичным кариотипом 45,Х/46,Х изоХ (мозаичнь1й 15 случай синдрома Тернера), индивида с кариотипом 49, XXXXY (синдром

Клайнфельтера) было проведено на препаратах лимфоцитов, как описано н примере 1. Все процедуры по гибриди- 20

1 зации ill sltU включая введение метки в плазмиду р УАИ 10/40А, денатурацию jglK, условия гибридизации и анализа препаратов, повторяются аналогично примеру 1 . Отл1гчия состоят лишь н том, что н этом примере используются клетки индивидов с разным содержанием хромосом Х.

С помощью Д1!К р УАИ 10/40А н клетках мужчины, содержащих одну хромосому Х, выявляется одно крупное скопление иэотопной метки, соотнетстнующей единственной хромосоме Х как в ме. тафазных, так и интерфаэиых хромосо»ах. В клетках женщин, содержащих 35 две хромосомы Х, выявляются Два скопления метки, соответствуют.их двум женским хромосомам Х. Анализ метафазных и интерфазных клеток индивида с мозаичным кариотнпом 45, Х/46, 40

Х изоХ значительно облегчается при использовании маркерной плазмиды р YAM 1 О/40А. При этом удается без применения методов дифференциального окрашивания хромосом по длине и де- 45 тального кариотипирования большого числа метафаэных пластинок, выявить клетки с одной и клетки с двумя хромосомами Х. Впервые создается воэможность надежно определить число хромосом Х в интерфазных клетках и определить долю клеток с разным числом хромосом Х при моэаицизме. Это особенно важно для анализа обраэцон

1 дифференцированных клеток разных 55 тканей, которые <е способны к делению,и, следовательно, провести стан° дартный анализ хромосом с помощью различных методоп онрашщвания не

Tlpf äà таял Нет н возможнь1м. Лн,lлич ин терфа злых клеток индивида с кариотипом 49, XXXXY однозначно показывает наличие н большинстве клеток 4 скоплений метки соотнетстнунчпих хромосомам Х. Следовательно, плаэмида для маркиронания хромосомы Х позволяет надежно пронглить диагностику различных вариантов полисомий по числу хромосом Х, н частности, часто встречающихся синдр1мон Ц1ереп1евского

Тернера и Клайнфельтера.

П р и и е р 3. Важной иллюстрацией практического применения маркерной плазмиды р YAM 10/40А для пренатальной диагностики пола или численных нарушений н системе хромосом Х служит нь1лвление хромосом Х в клетках, получеинь1х иэ материала биопсии хариоиа плода в пернг>м триместре беременности.

В этом случа» хромосомы Х выявляют в неделнщихся, натинных клетках норси 1ок хориона, полученных на 7-8 неделе беременности. Препараты интерфазиых ядер готовят методом отпечат-!!

1гов, для чего плотно прижимают биоп1 сийный материал к поверхности чистого сухого предметного стекла в нескальк 1х местах, н результате чего отдельные Kllåòêè прикрепляются к стеклу. Клетки фиксируют в течение

15 мин в метанол-уксусном фиксаторе (3:1) и высушивают на воздухе. Процедура приготовления препаратов клеток хориона длн последующей диагносТНКН занимает при этом способе не более 30 мии. Альтернативный способ получения цитологических препаратов заключается в суспендировании клеток хориона в гипотоническом растворе

0,075 М КС1 при комнатной температуре. После 15 мин воздейстния гипотоническим растнором клетки фиксируют дважды метанол-уксусным фиксатором (3:1) и раскапывают на предметные стекла, как в примере I . .Гибридизация ill sitU клеток хориона, с маркерной плазмидой проводится,как в приме- ре! .Микроскопический анализ реэультатон гибридизации показывает наличие в клетках одной или двух хромосом Х, что соответствует мужскому или женскому кариотипу. В этом способе диагностики удается определить число хромосом в неделящихся клетках ворсинок хориона в течение 2-3 дней. Альтернативные методы диагностики пола при

ll 494724 проведении пренатальной диагностики занимают 2-4 недели при использона нии методов хромосомного анализа в случаях культивирования клеток хориЪ биа или амниотической жидкости.

Таким образом, клонированная пос,1иедовательность gHK p YAM 10/40Л позволяет эффективно маркировать половую хромосому Х человека, что создает возможность для молекулярно-цитогенетической диагностики пола н первом триместре беременности (8-!О недель) в случаях наследственных боФормула

<пеэней, сцепленных с полом. Благода- 15 ря точности и быстроте метода правильный диагноз можно поставить в короткий срок. Кроме того, применяя этот способ, можно точно и быстро диагностировать наследственную патологию, свлзаннук с и<ленными нарушениями в системе половых хромосом, включал такие часто встречаемые типы хромосомной патологии, как синдромы Ц1ерешевского — Тернера (различные формы), Клайнфельтера (раз— личные формы), трипло-Х, а также сложные случаи мозаициэма по этим заболеваниям.

Ограничения предлагаемого способа с использованием интерфазпых ядер при проведе!ши пренатальной диагностики связаны с анализом индивицон с кариотипами 46, XY (нормальный мужчина) и 45, Х (синдром Тернера), а также 46, XX (нормальная женщина) и

47, XXY (синдром Клайнфельтера) . В этих случаях при специальных покаэакиях необходимо проводить анализ метафазных хромосом. Использование предлагаемого способа позволяет отказаться в случае анализа метафаэных хромосом от методон дифференциального окрашиванпя, поскольку половые

Х-хромосомы эффективно маркируются радиоактивной меткой. При проведении

10 постнатального определения числа

Х-хромосом, когда пол индивида уже известен, ограничений для применения метода нет. изобретения

Способ определения количества

Х-хромосом человека путем фиксации клеток пациента с последующим подсчетом Х-хромосом, о т л и ч а ю—

20 шийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, фиксируют интерфаэные клетки, которые дополнительно обрабатывают

0,07 И едким натром н течение 30 с, затем к ним добанллют радиоактивный

Д1!К-зонд и инкубируют до 18 ч при о

42 С н среде, содержащей солевой раствор 0,3 М хлористого натрия, 0,03 М цитрата натрия, 50Х формами30 да, IOX декстрансульфата, далее отмывают в том же растворе при физиологической температуре в четырех сменах раствора по 5 мин, покрывают препараты фотоэмульсией, проявляют

35 через 1-3 дня и подсчитывают число маркиронанных радиоактивной меткой

Х-хромосом н интерфазных ядрах клеток пациента.

Составитель A. Скурат

Техред А.Кравчук Корректор H. Муска

Редактор С. екона ч

Заказ 67 I Тираж 422 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэводственно-пэдательск«й к ";<«п<лт "Патент ", r.ужгород, ул. Гагарина, !01