Способ получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека
Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека с помощью рекомбинантной ДНК-технологии. Фрагмент ДНК, кодирующий проинсулин, получают путем клонирования гена млекопитающего. После клонирования в плазмиде PBR 322 его выделяют с помощью эндонуклеаз HHA 1 и ALU 1 или эндонуклеаз HHA 1 и модифицируют, присоединяя химически синтезированную нуклеотидную последовательность 3Ъ-TTTGTGAACCAACACCTGTCGGCT CACACCTGGAAG-5Ъ, кодирующую 14 аминокислот проинсулина.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
09) (И) <511 4 С 12 N 15/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 2994154/28-13 (22) 11.09.80 (31) 075192 (32) 12.09.79 (33) US (46) 30.06.89. Бюл. М 24 (71) Дэе Риджантс Оф Дзе Юниверсити оф Калифорния (US) (72) Грем Белл, Рэймонд Луис Пиктет, Говард Майкл Гудман и Вильям Дж. Раттер (US) (53) 575.224,2,577.2(088.8) (56) Ulrich А.et.al.Science 196, 1977, р.1313.
Изобретение относится к области генэтической инженерии и касается получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека с помощью рекомбинантной ДНК-технологии
Фрагмент ДНК, кодирующий проинсулин, получают путем клонирования гена млекопитающего. После клонирования в плаэмиде pBR322 выделяют его с помощью эндонуклеаэ HhaI u Alul u модифируют присоединяя химически синтезированную нуклеотидную последовательность 3 -TTTGTGAACCAACACCTGTGCGG
CTCAGACCTGGAAG-5, кодирующую 14 аминокислот проинсулина. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАГМЕНТА НУКЛЕИНОВ011 КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего проинсулин человека с помощью рекомбннантной ДНК-технологии, Фрагмент ДНК, кодирующий проинсулин, получают путем клонирования гена млекопитающего. После клонирования в плазмнде pBR 322 его выделя" ют с помощью эндонуклеаэ Hhal u
AluI или эндонуклеаз HhaI и модифицируют, присоединяя химически синтезированную нуклеотидную поспелова- Е
C тельность 3 -TTTGTGAACCAACACCTGTGCGG
CTCACACCTGGAAG-5, кодирующую 14 ами-. нокислот проинсулина.
Пример 1. PHK получают иэ человеческой инсулиномы после центрифугирования в 5,7 М CsC1, содержащем
100 мИ ЭДТУ, и используют беэ дальнейшего фракционирования в качестве шаблона для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы и S1нуклеазы, Приблизительно 40 нг двухнитевой кДНК получают из 130 мкг нефракционированной РНК.
Нефракционированную кДНК обрабатывают концевой трансферазой в присутствии дЦТФ для получения олиго-Схвостов на 3 -концах молекул кДНК.
Плазмиду pBR322 расщепляют энцонуклеазой ограничения Pst I и обраба1494345
55 тывают концевой трансферазой в присутствии dGTP для получения олнго1
dG-хвостов на 3 -концах линейной плазмидной ДНК.
Сшивают полученные фрагменты и получают кольцевую плазмиду.
Штамм Е.coli Х1776 трансформируют с использованием плазмидных ДНК-содержащих вставок ° Получают 525 резистентных к тетрациклину трансформантов. Их реплицируют высевом и классифицируют на инсулиновые последовательности с помощью гибридизации колоний (in situ),. Ранее клонированную кДНК препроинсулина крыс используют в качестве пробы для гибридизации, после метки кДНК крыс — с помощью
Nick-трансляции с применением ДНК-полимеразы IÄ Поскольку аминокислотные последовательности инсулинов крыс и человека довольно сходны (инсулин, 927. гомлогия; проинсулин, 837. гомлогия), предполагают, что клонированная, кДНК крыс будет испытывать кросс-гибВ ридизацию с последовательностями человеческого инсулина в нежестких условиях. Авторадиографией выявляют, что две из 525 колоний гибридизированы с пробой клонированного препро— инсулина-I крыс. Обе колонии чувствительны к ампициллину. Выделенные иэ колоний плазмиды приблизительно на 250 пар оснований (bp) и на 500bp длиннее, чем сам pBR 322. Более длинную плазмиду обозначают как pcHI-I.
Нуклеотидную последовательность вставленного кДНК фрагмента pcHI-I определяют методом Maxam and Gilbert.
Пример 2. нДНК вставка pcHI-I содержит полную кодирующую последовательность для человеческого препроинсулина.
ДНК синтетического проинсулина обрабатывают Alu-I-эндонуклеазой для получения двух фрагментов размером
43 Ър и 56 Ьр. Аналогично кДНК-вставку pcHI-I предпочтительно полученную с помощью обработки Hh à I, расщепляют частичным гидролизом, каталиэируемым Alu-I-эндонуклеазой с образованием фрагментов по 75, 90, 110, 135, 165, 200, 245, 275, 375 и 455 Ър соответственно их фракционируют методом гельэлектрофореза с получением фрагмента 375 Ър, который получается в. результате разрыва в одном местоположении в кодоне для аминокислоты М 14.
50 фрагменты расщепления синтетического гена и фрагмент 375 Ьр соединяют с помощью тупоконечной лигатуры, Точное соединение синтетического фрагмента размером 43 bp с 375 bp кДНК-фрагмента максимизируют при условии, что 375 Ьр кДНК присутствует в молярном избытке. Возможности для неточного соединения также минимизируют тем, что синтетические фрагменты имеют однонитевые выступающие концы, которые не являются комплементарными концами 375 bp кДНК-фрагMPHTB °
Объединенный фрагмент, содержащий синтетическую последователъность для метионина (1-13 аминокислот), и встречающаяся в природе последовательность кодирования для аминокислот 14-86 проинсулина составляет последовательность кодирования для проинсулина.
Проинсулин-кодирующую последовательность конструируют избирательным разрывом у внутреннего положения в проинсулин-кодирующей области с последующим пришиванием химически синтезированной последовательности, кодирующей ту часть проинсулин-кодирующего участка, который удален предшествующим расщеплением. Плазмиду
pcHI-I используют в качестве источника проинсулин-кодирующего участка, который избирательно исключают обработкой Hhal-эндонуклеазой.
Любой фрагмент после выделения обрабатывают щелочной фосфатазой для удалейия 51-концевых фосфатных групп, затем расщепляют эндонуклеазой Alu I имеющей уникальную точку расщепления в области 13- 14 аминокислот в прони сулин-кодирующей последовательности.
Местоположение ограничения предпочтительно располагают вблизи одного иэ, концов проинсулин-кодирующей последовательности. НЬа?-фрагмент — pcHI-I частично разрывают AluI-эндонуклеазой с получением двух фрагментов длиной приблизительно 76 Ьр и 375 bp соот-, ветственно. AluI-фрагменты фракционируют методом гельэлектрофореза и выделяют фрагмент 375 Ър.
Нуклеотидную последовательность, кодирующую первые 13 аминокислот проI инсулина с 5 -концевым С (на плюс-нити), для завершения кодона на алании в положении 14 синтезируют фосфотри5 l494345
6 эфирным методом. Плюс-нить синтетиче- Пример 3. Клонированные ской fgIK и: ет последовательность: вставки, кодирующие на препроинсулин
3 -TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTG- (пример 1) или проинсулин (пример 2), GTGGAAG"5,соответствующую природной вставляют в вектор переноса экспреспоследовательности, сии. Когда вставка происходит при
Результирующей последователь- правильной ориентации. относительно ностью является последовательность, начала трансляции у местоположения сшитая тупым концом с приблизительно вставки, она находится в Фазе отно375 bp Фрагментом HhaI Фрагменто 10 сительно фрейма считывания.
pcHI-I. Поскольку последний имеет
В
5 -фосфат только На присоединяемом Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я конце, два фрагмента соединяют в правильном порядке. Синтетический фраг- I. Способ получения фрагмента нумент правильным обраэом соединяют с ig клеиновой кислоты, кодирующего проинбольшим фрагментом в приблиэительно сулин человека со следующей нуклео"
507 реакции. тидной последовательностью:
-74 - -70 -fO
met a1o feu trp met org 1ен 1ен pro 1еи 1еи ofa feu !еи afa !еи
CCTTCTCCCATG ССС СТС ТСС ATG ССС CTC CTG CCC СТС СТС ССС СТС СТС ССС СТС .1гр 91У
ТСС ИА 554 Ю
1 f0
pro osp pro о1а а1а ata phe vaf asfl 9fll IIIs 1си сую д!у зег his 1еи 5Lf ggg
CCT CAC CCA GCC GCA GCC ТТТ СиС AAC САА CAC CTC ICC CCC ICA CAC СТС CTG АЯ
14 gC Gn
afa 1еи ЭГ
ССТ СТС Щ И1
А1н 20 ла
tyr 1ен vat суз gty д1н огд д1у phe phe tyr thr pro fys thr агу агу у1у afo
TAC CTA CTC ТСС ССС CAA ССА ССС TTC ТТС TAC АСА ССС ААС АСС ССС ССС CAC CCA
gta osp
САС САС ео,70
teu д1н vof gty gtn vot gfII Феи gtg д1и дну pro gty а1а д1у ser feu дЬ pro
СТС С4С GTG ССС ССС СТС С4С CTG ССС ССС GGC ССТ GGT GCA ССС AGC СТС CAG ССС
ИС Е еи afa
ТТЬ ССС
И 7Ю ахеи gtII gfy зег feu gtn tys arg е1н tte vat glu tn» cys cys thr ser Etc суз
CTC GAG ССС ТСС СТС CAG AAC ССТ ССС ATT СТС САА CAA TCC TCT АСС AGC АТС TCC
ser 1сн
TCC CTC ва вб
tyr gfn teu у1н asm t r cys ащ
ТЛС (AC СД СЛС ААС ТЛС ТОС AAC ТАС ACCCACCCCCCACCCAGCCCCCCA CCCCCCCCCTCCTCCA
А 1 1
Я 11 f f
С CCACALACATGGAATAAACCCCTTGAAC CAGC
1494345 выделяют фрагмент длиной 375 bp u лигируют ДНК-лигазой Т с фрагментом длиной 43 Ър химически синтезированной нуклеотидной последовательности
3 -TTTGTGAACCAACACC TGTGCGGCTCACACCT
GGTGG AAG-5, кодирукицей 1-14 аминокислоты проинсулина, оканчивающейся сайтом Alu I. заключающийся в том, что клетки островков Лангерганса центргфугируют в растворе, содержащем 5,7 М CsC1 и !00 мМ ЭДТУ, отделяют РНК препроинсулина, синтезируют кДНК, полученную кДНК встраивают в PstI сайт плазмиды pBR 322 с помощью dA-олиго- dTметода, трансформируют рекомбинантной плазмидной ДНК штаммы бактерий
Escherichia coli и отбирают клоны, гибридизующиеся с клонированной кДНК препроинсулина крыс, содержащей радиоактивную метку, выделяют из них плазмиду pcHI-I со вставкой кДНК пре- 15 проинсулина, обрабатывают pcHI-I эндонуклеазой НЬа I с последующим частичным гицролиэом AluI эндонуклеазой, 2. Способ по п.l, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиду pcHI-I обрабатывают эндонуклеазой Hhal, выделяют фрагмент длиной 375 Ър, который тупоконечно лигируют с нуклеотидной последовательностью 3 -TTTGT
GAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAC-5
Составитель H.Êóçåíêîâà
Редактор М;Келемеш Техред А.Кравчук Корректор М.Максимишинец
Заказ 3765/59 Тираж 500 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r.ужгород, ул. Гагарина,101
