Рекомбинантная плазмидная днк р28сме, кодирующая синтез полипептидов для получения живой рекомбинантной вакцины против клещевого энцефалита, и способ ее конструирования

 

Изобретение относится к генети-j ческой инженерии и биотехнологии и может найти применение при получении живых вакцин против клсгаевого энцефалита . Рекомбинантная гигаэмидная i ДНК р28СМЕ состоит из фрагмента генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) промотора вируса осповакнины (нов) вектора, обеспечивающего встройку рекомбинантных ДНК в ДНК ВОВ. В качестве фрагмента генома ВКЭ используют фрагмент ДИК длиной 1775 п.о., кодирующий все структур- Hf-ie белки за исключением Ы концевых амитюкислот белка С и С-концевой чпсти белка Е а также синтетический фрагмент ДНК, 1 одирую га1й 3 и 4 аминокислоты белка С. В качестве промотора используют синтетический фрагмент ДНК ДЛИ..ОЙ 174 п.о., содержании 28к промотор. В качестве вектора дпп встройки описанных выше последовательностей в ДНК ВОВ испольгуют плат миду pVAR 15, обеспечивающую интеграцию структурных генов ВКЭ в ген тимидинкинаэы ВОВ. Рекомбинантные вирусы осповакцины, полученные на основе пере шсленных компонентов, экспрессируют полипоптиды, связываюгциеся с антителами против ВКЭ, при инфицировании ими клеток CV-1. 2 с.л. ф-лы. (Л 4 СО О СО У со

СОЮЗ СОВЕТСИИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

SU 1490963 (1) 5 С 12 Н 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (46) 07.07.93. Бюл, Р 25 (21) 4289094! 13 (22) 27,07,87 (71) Всесоюзный научно-исследо»ательский институт молекулярной биологии и Новосибирский институт био" органической химии СО AH СССР (72) А,С. Беляе», A.A. Хромых, Э.Г. Малыгин, А.Г. Плетне», Л,Э,М»твеев, JI,Р. Невлягина, Н,И, Путинцева, Н.К. Данилюк, И.А. Вторушина, А.Н. Синяков, Г. Г. Приходько, Л,В, Мамаев, В.А, Куличко», B,Ф,Ям" щиков, Е.10 ° Добрикова и E,К. Прессман (56) Плетнев A. Г,, Ямщи ков В,Ф,,,Блинов В.М. Биоорганическая химия, 1986, 11(3 (!2), 1189-1202, ((54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗКЩНАЯ ДНК р28СМЕ, КОДИРУ10ЯАЯ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ВАКЦИНЫ IIPOYHB КЛЕ11ЕВОГО

ЭНЦЕФАЛИТА, И СПОСОБ EE КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Иэобретеггие относится к генети- ческой инженерии и биотехнологии и может найти применение при получении

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии, конкретно к получению живой рекомбинант ной вакцины против клеще»ого энцефалита на основе »ируса осповакцины.

Целью изобретения я»ляется создание рекомбинат»ой »паэмидной ДНК, живых вакцин против клсщевого энцефалита. Рекомбинантная пнаэмидная

ДНК р28СМЕ состоит иэ фрагмента генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) промотора вируса осповакцины (BOB вектора, обеспечивающего

»стройку рекомбинантных ДНК в ДНК

ВОВ ° В качестве фрагмента генома

ВКЭ используют фрагмент ДНК длиной

1775 п.о,, кодирующий »се структурные белки за исключением М-конце»ых аминокислот белка С и С-концевой w(tcти белка Е, а также синтетический фрагмент ДНК, кодирующий 3 и 4 аминокислоты белка С. В качестве промотора используют синтетический фрагмент ДНК дли..ой 174 п.о,, содержащий

28к промотор. В качестве вектора для встройки описагпгь(х вьппе последо»ательпостей в ДНК BOB исполь уют плазмиду pVAR 15, обеспечивающую интеграцию структурных генов ВК3 в ген тимидннкинаэы ВОВ, Рекомбинантные вируcb1 осповакцины, полученные на основе пере гисленных компонентов, экспрессируют полипептиды, связывающиеся с антителами против ВКЭ, при ннфицировании ими клеток CV-1. 2 с.п, ф-лы, содержащей комплекс стрчктурных генов ВКЭ и обеспечивающих синтез антигенных полипептидов ВКЭ в клетках млекопитаюпих, Поставленная цель достигается l(o» струировапием рекомбинантной плазмидной ДНК р28СМЕ, к(д»рч» (ц (i спите.i

I 49096 3 структурных бенков ВКЭ для получения живой вакцины против клещевого энцефалита. Осуществлена экспрессия генов структурной оболочки ВКЭ под контро5 лем 28 к промотора вируса осповакцины.

П .р и и е р, Рекомбинантная плазиидная ДНК р28СМЕ и способ ее конструирования. 10

В соответствии с известной струк" турой ДНК проводят химико-фермента-, тивный синтез промоторного фрагмента

ДНК, нри этом в целях удобства сборки проиотора вводят ряд изменений 15 в первичную структуру ДНК. Проводят синтез 25 олигонуклеотидов длиной

12-!8 оснований, составляющих ограниченную сайтами HindIII u EcoR эндонуклеаэ рестрикции последовв" 20 тельность промотора длиной 174 пары оснований (п.о.). Олигонуклеотиды сшивают ДИК-лигаэой в несколько дуплексоЪ, которые затем обьединяют в один длинно-протяженный фрагиент тем же ферментом. Синтетический äóплекс клонируют по Hind III u EcoRI сайтам рестрикции в плвзмнде pBR 322, Полученную плазмиду обозначили р28.

Иэ плазмиды рБК 292, в которой 30 клонирован PetI-PstI фрагмент кДШ(ВКЭ длиной 1900 п,о,, выделяют этот фрагмент и расщепляют его в стандарт с ных условиях Fok 1 - рестриктазой, 2 мкг Fok I - гидролизата лигируют у с 0,1 мкг синтетического фрагмента

ДНК (линкера), имеющего следующую структуру:

5 Ф-ААТТТСААС-ОН 3 ОН

/ !!! l! 40

ЗОН-АСТТССААТ5 Ф

При этом происходит замещение Pst I

Fok I фрагмента ДНК длиной 60 п.о., содержащего нетранслируеьаай участок геноиа ВКЭ и AUG-кодон íà EcoRI-Fok I-45 синтетический фрагмент ДНК, а также восстановление целостности остальной части фрагмента к ДНК ВКЭ, Этот

EcoRI-Pst I фрагмент ДНК длиной

1853 п.о. сшивают с EcoRI гидролизованной ДНК плазмиды р28 °

Продукты сшивки расщепляют EcoRIрестриктазой при этом образуется

EcoRI фрагмент ДНК длиной 6292 п.о., состоящий иэ плазмиды р28 длиной

4508 п.о. и фрагмента длиной 1784 п.о. от EcoRI " сайта к ДНК ВКЭ до EcoRZ -. сайта синтетического фрагиента ДНК.

Выделяют FcoRI фрагмент ДНК длиной

6292 и. п,, лигируют ei o и лига i«ii

I смесью трансформируют компетентные клетки Е. со11 НВ 10l, Трансформанты высевают на среду с ампициллииом, В клонах, содержащих плазмиду р28 со встроенным фрагментои, определяют ориентацию последнего с помощью

EcoRI u Bam HT зндонуклеаз рестрикции. Из полученной таким образом плазмиды р2823, содержащей правильно состыкованные 28к промотор и структурные гены ВКЭ, выделяют BamHIEcoRI фрагмент ДНК длиной 2304 п.о, Фрагмент состоит из BamHI-HindIII фрагмента ДНК плазмиды pBR 322 длиной 346 п.о., HindIII-EcoRI синтетического фрагиента ДНК длиной

174 п.о. и EcoRI-EcoRI фрагмента

ДНК длиной 1784 п.о,, содержащего гены ВКЭ, Для окружения промотора и генов ВКЭ участкаии ТК-гена ВОВ выделенный BamHI-EcoRI фрагмент лигируют с большии BamHI-EcoRI фрагментом ДНК вектора р VAR 15 и лигазной смесью трансформируют хомпетентные клетки Е. coli HB101. Искомые клоны идентифицируют методом

ДНК вЂ” ДНК гибридизации на Р-мечез2 ный Pet I-Рв I фрагмент к ДНК ВКЭ, Наличие в клонах BamHI-EcoRI фрагмента ДНК длиной 2682 п.о. определяют при помощи EcoRI u BamHI рехтриктвэ. Полученный такии образом клон бып обозначен р28СМЕ. ДНК плаэииды р28СИЕ, содержащую гены всех структурных белков ВКЭ, эв исключением

С-концевой части белка Е, используют для трансфориации клеток почек зеленой мартышки линии CV-I, зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИВП, Урожай вируса после трансформации высевают на монослой перевиваемой линии клеток Н!43 (tk ). В присутствии

25 мкг/мл культуральной среды отбирают tk вирусные клоны, методом

ДНК-ДНК гибридизации нв фильтрах проверяют наличие нуклеотидных пос" ледоввтельностей ВКЭ в клонах. Кло" ны ВОВ, гибридиэующиеся с к ДНК ВКЭ, наращивают на клетках CV-1 на среде

ИГЛА МЕИ с 2Х сыворотки новорожденных телят, В пробах, содержащих клеточные лизаты и культуральные жидкости, определяют наличие внтигена ВКЭ иммуноферментныи методом с пероксидазой хрена. Во всем исследованных образЭ ! 4)09б 3 цях был об)«)ру;. н я)гги) сн ВК1 н к<)нцентрации 30- !00 нг/л)л.

Vfffff

Ф о р м у л а и э 0 б р е т е и и я

10

FokI-EcoRI фрагмент ДНК размером

1775 п.о. кодирующий структурные белки вируса клещевого энцефалита

С, ° EcoRIWindII фрагмент ДНК вируса осповакцины, кодирующий С-концевую часть тимидинкинаэы вируса осповакцины размером !07! п.о., генетические маркеры Ь1а-ген ампициллннрезистентности, определяющий устойчивость.к ампициллину при трансформации Е. coli, прерванный ген тимидннкинвэы вируса осповакцины, обуславливающий

ТК -фенотип при трансформации ТК+ вируса осповвкцины;

Составитель А. Спундз

Техред А.Кравчук Корректор C. Черни

Редактор Л, Павлова

Заказ 2832 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн I KHT СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,!01! Рекомбинантна я плаэмидная ДНК р28СМЕ, кодирующая синте э полипептидов для получения живой рекомби< нантной вакцины против клещевого энцефалита, мол, м. 4,22 мегадяльтон и размером 6754 п,о., содержащая

Hind II1.-Рчо 11 фрагмент ДНК плаэмиды pBR 322 размером 2326 п,о. с геном ампициллинреэистентности и участком инициации репликации;

Hind III EcoR1 фрагмент ДНК вируса осповакцины размером 767 п,о,, кодирующий N-концепцию часть тимидинкинаэы вируса осповакцины;

HindII-RsaI фрагмент ДНК вируса

Ф осповакцины размером 280 п.о. с

7 ° 5K прОмОТОРОм!

Hind?I-BamHI линкерный фрагмент

ДНК плазмиды pUC размером 9,6 п,о.;

BamHI HindIII фрагмент ДНК плаэмиды pBR 322 размером 346 п,о,;

HindIII EcoRI синтетический фрагмент ДНК с 28к промотором вируса осповакцины размером 174 п .о.;

EcoRI-Fok1 синтетический фрагмент ДНК размером 9 п.о.;

ых эндонуклеяэ.

EcoR1 — сяйт, )i.lc;<ол )же<нный между

С-концевой часть)< f еIM ):. l )< < я f

ЩЕВОГО ЭНЦЕфап))та ll ДРЯ)«, Ч;)Ствв фланга г К-гена вируса «. и«< я кци))ы

Вяп)Н1 — сяйт, рясположе))ный между

7,5к и 28к промоторями н))руся < сповакцины.

2. Способ конструир<<<«,)<)« < к< мбинантной плаэмиднои ДНК р28<",)!;, коднрующей синте:.)< долипептидо)<, .. « получения живой рекомбиняит))ой ll<)ь1<ины, 15 против клещевого энцефалит, эаключающийся в том, что Pst 1-Pst I фрагмент кДНК вируса клещевого энцефа. нта укорачивают Fokl — рестр))ктяэой, соединяют посредством Fok1 — ЕсоК

2р линкера полученный фрагмент кДНК с клонированным в плаэмиде рВК 322

HindIII-EcoRI синтетическим фрагментом ДНК, содержащим 28к промотор вируса осповакцины, образовавшиеся ре25 комбинантные ДНК дореэают го Е ОК1сайту, расположенному в С-концевой части гена Е вируса клещевого энцефалита, и циклиэуют при помощи ДНК- люгазы, затем полученными рекомбинант30 ными молекулами ДНК трансформируют клетки E.coli НВ 101, трянсформанты высевают на среду с ампициллином, иэ выросших клонов выделяют плаэмидиую

ДНК, вырезают иэ нее ВяшНI-EcoRI фрагмент, содержащий состыкованные с 28к промотором вируса осповакцины гена структурных белков вируса клещевого энцефалита, встраивают его в . ° ДНК вектора р VAR !5 между Вяп)Н1

4p EcoRI-сайтами для окружения укаэанного фрагмента участками гена тимидинкинаэы вируса осповакцины, трансформируют полученными рекомбинянтнымн ДНК клетки E. coli НВ .!01, нужные

45 клоны, идентифицируют методом ДНКДНК гибридизации с меченным P

31

PstI-PstI фрагментом кДНК вируса клещевого энцефалита и выделяют из них целевую плаэмиду р28СМЕ.