Способ получения рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей синтез бычьего или человеческого гормона роста

 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и касается способа конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих синтез бычьего или человеческого гормона роста. Цель изобретения - повышение выхода метиолинового гормона. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК путем объединения BAM H 1 - XBA 1 или BAM H 1 - ECOR 1 фрагмента плазмиды PC4101 с XBA 1 - BAMH 1 фрагментом плазмиды PNM 789в с BAM H1-FNU2 фрагментом плазмиды PNM575. Дополнительно к полученной рекомбинантной плазмидной ДНК можно присоединить ECOR1-CLA1 фрагмент плазмиды PNM 608. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК д 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3862498/28-13 (22) 04 ° 03.85 (31) 586592 (32) 06.03.84 (33) US (46) 30.06.89. Бюл. У 24 (71) Эли Лилли энд Компани (US) (72) Рональд Джордж Шонер и Бригитте Элизабет Шонер (US) (53) 575.224.2.577.2(088.8) (56) Патент GB У 2121054, кл. С 12 N 15/00, 14.12.83. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ

ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ

БЪ|ЧЬЕГО ИЛИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГОРМОНА

РОСТА

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и касается способа конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих синтез бычьего или человеческого гормона роста.

Целью изобретения является повышение выхода метионинового гормона роста.

Конструирование плазмиды осуществляют путем объединения BamHI-XbaI или BamHI-EcoRI фрагмента плаэмиды

pCZI0l c XbaI-BamHI фрагментом плазмиды pNM789b с BamHI-FnuII фрагментом плазмиды рЪ1М575. Дополнительно к полученной рекомбинантной плазмидной ДНК присоединяют EcoRI-ClaI фрагмент плазмиды pNM608 с синтетическим линкером...SU„„1491346 A 3

2 .(57) Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и касается способа конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, кодиp mHõ синтез бычьего или человеческого гормона роста. Цель изобретения — повышение выхода метионинового гормона. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК путем объединения BamHI-Xb;, Т или BamHI-EcoRI ! фрагмента плазмиды рС4101 с XbaIВаш1П фрагментом плазм: ды рЫМ789в с BamHI-FnuIT фрагментом ллазмиды

pNM575. Дополнительно к полученной рекомбинантной плазмидной ДНК можно присоединить EcoRI-ClaI фрагмент плазмиды рЪ1М608, 2 табл., Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В качестве исходного материала используют " 5,1кЬ фрагмент, полученный Xbal-ВатпНТ рас— щеплением плазмиды РКЕ11021.

Плазмиду pKEN021 получают из

pKENIII :ледующим образом: Около

50 мкг pKKNIII выжигают 25 ед. HpaII рестрикционного фермента в 300 мкл буфера, содержащего 20 мМ НС1 (pH 7,4), 10 мМ MgCle и 6 мМ Ь-меркаптоэтанола, при 37 С в течение

2 ч, Полученную смесь дважды экстрагируют 300 мкл смеси (50:50) фенола и хлороформа. Выделенную водную фазу осаждают затем 2,5 объемами этанола и 0,1 объемами 3М ацетата натрия, ДНК растворяют в 100 мкл электрофо1491346 резного буфера и фракционируют на

5Х-ном полиакриламидном геле (акриламид:бис отношение составляет 29:1 во всех гелях, кроме тех, на которые есть специальное указание). Гель окрашивают в растворе, содержащем

0,5 мкг/мл этидиумбромида, и проявляют полосы длинноволновьм ультрафиолетовым излучением. Полосу 950Ьр выделяют и извлекают из еля электроэлюированием в камере диализа. Затем проводят экстракцию смесью фенол/СНС1 и осаждение этанолом.

Выделенные ДНК (приблизительно

2,5 мкг) растворяют в 25 мкл TEN (10 мМ NaC1, 10 мИ Tris HC1, рН 7,4, и 1 мМ натрийэтилендинитрилтетраацвтата ЕДТА), рН 8,0).

Около 2 мкг 950Ьр Hpall фрагмента выжигают A1UI рестрикционным ферментом в 200 мкл буфера, содержащего

50 ьИ NaC1, 6 мМ Tris, НС1 (рН 7,6), 6 мМ MgClq и 6 мМ Р -меркаптоэтанола, в течение 2 ч при 37 С. ДНК фрак! ионируют на 6Х-ном полиакриламидном геле. Полученный 462Ър AluI фрагмент выделяют и очищают описанным ранее способом. Фрагмент 4 2Ьр AluI (приблизительно 1 мкг) растворяют в

10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера (66 мМ Tris НС1, рН 7,6; 10 мМ MgCQ, 1О мМ дитиотретиол, 0,4 мМ АТР), содержащего 150 пмоль фосфорилированного Есок? линкера (5 GGAATTCC3 ) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы. После инкубирования при 4 С в течение !6 ч полученную смесь нагревают при 65 С в течение 10 мин и разбавляют до

1000 мкл, добавляя EcoRI буфер (100 мМ Tris НС1, рН 7,2; 50 мМ

NaC1, 10 мМ МяС1, 6 мИ р-меркаптоэтанола) и 40 единиц EcoRI фермента. Спустя 2 ч при 37 С образец экстрагируют смесью фенол/СНС1> и осаждают этанолом. ДНК растворяют в

20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего О, 1 ед. Т4 ДНК лигазы и

0,1 мкг pBR322/102, которая была сначала линеаризирована EcoRI, а затем обработана щелочной фосфата0 зой. После лигирования при 4 С в течение 16 м полученную ДНК используют для обычной трансформации

Е.coli штамм К12 НВ101.

Трансформанты выбирают на агарных пластинах, содержащих 12 мкг/мл тетрациклина, плазмиды изолируют из устойчивых колоний методом быстрой щелочной экстракции. Плазмиду, содержащую 466Ър XbaI-BamHI фрагмент, выбирают и используют в качестве исходного материала на описанной далее стадии.

Около 2 мкг этой плазмиды выжигают 2 ед. HindIII фермента в 50 мкл

HindIII буфера (50 мМ NaC1, 10 мМ

1p Tris НС1, рН 7,4; 10 мМ MgC1 и

6 мМ Р-меркаптоэтанола) в течение часа при 37 С. После экстрагирования о смесью фенол/СНС1 и осаждения этанолом ДНК растворяют в 200 мкл буфера, !

5 содержащего 300 мМ NaC1, 30 мМ натрийацетата (рН 4,25), 1 мМ 2пС1д и

200 ед. 81нуклеазы. Спустя час при

15 С реакцию останавливают экстракцией смесью фенол/СНС1 и осаждением этанолом. Полученну10 ДНК растворяют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилированных

BamHI линкеров (5 CCGGATCCGG3 ) и

2 ед. Т4 ДНК лигазы. Спустя 16 ч

25 при 4 С реакционную смесь нагревают при 65 С в течение 10 мин для инактивации лигазы, а затем разбавляют до 100 мкл в BamHI буфере (150 мИ

NaC1, 20 мМ Tris НС1, рН 8,0; 10 мМ

30 MgClq, 6 мМ (Ь-меркаптоэтанола), содержащем 20 ед. BamHT фермента. Спустя 2 ч при 37 С полученную смесь очищают на !Х-ном агарозном геле. Гель окрашивают, больший фрагмент (4,5 МЬ) выделяют элюированием после вымораживания, а затем очищают, экстрагируя смесью фенол/СНС1 и осаждая этанолом. Выделенный фрагмент с BamHI липкими концами растворяют в 20 мкл

40 Т4 ДНК лигаэного буфера, содержащего

0,1 ед. Т4 ДНК лигазы. Спустя 16 ч при 4 С ДНК используют для трансфор мацни Е.coli HB1 Ol. Трансформанты отбирают по устойчивости к ампициплину.при 100 мкг/мл и скринируют по чувствительности к 10 мкг/мл тетрациклина. Некоторые плазмиды, являющиеся Ар Тс, исследуют на отсутстГ вие HindIII сайта и присутствие одиночного BamHI сайта. EcoRI, SaII

50 последовательная обработка дает фраг— мент 466 и 305Ър.Плазмиду с такими характеристиками отбирают, а затем модифицируют для превращения EcoRI сайта, расположенного раньше lрр

55 промотора, в Н пй111 рестрикционный сайт.

2 мкг плазмиды гидролизуют в

100 мкл EcoRI буфера с 0,2 ед. EcoRI

5 !4 в течение 10 мии при 37 (:, Реак цию останавливан т, нагревая в течение

10 мин при 65 (:, а посл экстрагирпвания смесью Аеиол/СНС1 ДНК осаждают этанолом, растворяют в 200 мкл

SI нуклеазного буфера, содержащего

SI нуклеазу при 1000 ед/мл, и ведут реакцию при 12 С в течение часа. о

Реакцию останавливают экстрагироваиием смесью фенол/СНС1ь и осаждением этанолом. Полученную ДНК вновь суспендируют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилированного HindIII линкера (5 CCAAGCTTGG 3 ) и 2 ед, Т4 ДНК лигазы. Спустя 16 ч при 4"G смесь на-, гревают в течение 10 мин при 65 С, разбавляют до 150 мкл HindIII буфером, содержащим 10 ед. HindIII фермента, инкубируют в течение 2 ч при

37 С, а затем фракционируют на 17-ном агарозном геле. Самую большую полосу (эквивалентную единичному отрезку плазмиды) обычным способом выделяют и очищают, растворяют в 20 мкл Т4 лигазного буфера, содержащего 0,2 ед.

Т4 лигазы, инкубируют 16 ч при 4 С, а затем используют для трансформации

Е.coli НВ101. Трансформанты отбирают по устойчивости к ампицил .ину, выделенные плазмиды анализируют обычным способом рестрикционным ферментным анализом. Отбирают плазмиду с

EcoRI-HindIII фрагментом 500Ьр и используют в качестве клонирующего вектора для добавления 3 участка lрр гена.

Около 2 мкл плазмиды выжигают в

50 мкл SaII рестрикционного буфера (150 мМ NaC1, 6 мМ Tris НС1, рН 7,9;

6 мМ MgC1, 6 мМ !5-меркаптоэтанола) с 2 ед. SaII в течение часа при

37 С, а затем разбавляют до 150 мкл в BamHI буфере, содержащем 2 ед.

BamHI. Спустя час при 37 С добавляют

2,5 ед. щелочной фосфатазы, а затем продолжают инкубирование в течение часа при 65 С. Материал экстрагируют смесью фенол/CHC1, осаждают этанолом, растворяют в TEN и используют в качестве клонирующего вектора для фрагмента 1рр 3 .

Для получения фрагмента, содержащего 1рр 3 участок, 10 мкг pKENIII выкигают в 100 мкл Нра? буфера (20 мМ КС1; 10 мМ Tris НС1, рН 7,4;

10 мМ MgC1 и 6 мМ Р-меркаптоэтанола) с 10 ед. HpaI в течение 2 ч при

9! 346 6 7 "(, е ПГ)сл(3KcT ps Гnpon:31!nR c 1(Гьí феиол/СНС1 и осаждения этаиолом

1О

m!! растворяют в 0 мкл Т4 ПН! лигазиогo буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилироваииого SaI I линкор» (5 СGTCGACC 3 ) и 2 ед, Т4 ДНК лигазы, а затем иикубируют в течение

16 ч при 4"Г. !игаэу ииактивируют, нагревая при 65 С в течение 10 мин.

Полученный материал разбавляют до

100 мкл в Ба?1 буфере, содержащем !

0 SаТТ, инкубируют в течение часа при 37 С, а затем разбавляют до 300 мкл в PVUII буфере (60 мМ

NaCl Ь мМ Tris. НС1, рН 7,5; 6 мИ

MgC1 ) 6 мИ P — меркanтоэтанола), содержащем 10 en. PVUII рестрикционного фермента. Спустя час при 37 С

ДНК фракиионируют на 57-ном полиакриламидном геле. Приблизительно

0,5 мкг 950bp фрагмента выделяют, очищают и растворяют в ТЕМ, 0,02 мкг фрагмента разбавляют в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилированиого BamHI линкера (5 CCGGATCCGG3 ) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы, а затем инкубируют в течение

16 ч при 4 С. Полученную ДНК нагре- вают в течение 10 мин при 65 С, разбавляют до 100 мкм BamHI буфером, содержашим 20 ед. BamHI, инкубируют в течение 2 ч при 37 С, а затем фракционируют íà 5Х-ном полиакриламидном геле до удаления избытка линкерных молекул. Полученный 950bp фрагмент, содержащий BamHI u SaII липкие концы, обычным способом очищают и растворяют в 20 мкг Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 0,2 мкг клонирующего вектора, описанного ранее, и 0,2 ед.

Т4 ДНК лигазы. После инкубирования в течение 16 ч при 4 С ДНК используо ют для трансформирования Е.coli K12

НВ101. Плазмиды получают из устойчивых к ампициллину трансформаторов и обычным способом анализируют на наличие SalI-BamHI фрагмента. Целевую плазмиду ("5,2kb) обозначают рКЕИ021.

10 мкг pKEN021 выжигают при 37 С в 200 мкл XbaI/BamHI буфера (150 мМ

NaCl, 10 мМ Tris НС1, рН 8; 10 мМ

MgC1g 6 мМ Р-меркаптоэтанола), используя 10 ед. ВашНТ в течение часа, а затем 10 ед, XbaI еще в течение часа при 37 С. Целевую XbaI-BamHI выкженную ДНК обрабатывают затем

2,5 ед. щелочной фосфатазы в течение 1,5 ч при 65 С, экстрагируют

1491346 хЬв1

5 СТАРАСИТАТТААТААТРТТСССАТТССАТ&АТФАТОАТАЛСТТСССААт т т t t т т т t т т I t t t t l ò т е е т т f t t t I t е е t ò å I I т t e I t е т е е е

3 ТСССАТААТТАТТАСААФЮСТААССТАСТАСТАСТАТТСААМИТCCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTCACAACGCTATOCTCCO 3 т Emanent

t I1l l t 1 Ill f f1f f f f f f f f f f f f f tте f tl11f f t t1

GGTAAGGGAATLGGTCCGAAAAAGTGTTGCGATAGGAGGG т смесью фенол/СНС1э, осаждают этанолом и растворяют в 50 мкл TEN для дальнейшего использования °

Плазмиду ptrpED50chGH800 исполь5 зуют в качестве источника ДНК фермента, содержащего кодирующую последовательность для части гена гормона роста человека. Генная часть плаэмиды ptrpED50chGH800 человеческого гормона роста содержит уникальный ,SmaI рестрикционный сайт на 6Ър после трансляционного терминационного кодона гена. Этот сайт заменяют на

BamHI сайт, используя нижеследующую методику: 6 мкг плазмиды выжигают

6 ед. Вша? в 200 мкл SmaI рестрикционного буфера (15 мМ Tris.ÍÑ1, рН 8,0; 6 мМ МяС1,.15 мМ КС1 и 6 мМ -меркаптоэтанола) в течение 1,5 ч 2р при 37 С. После завершения выжигания осуществляют экстракцию смесью фенол/СНС1з, вьщеляют ДНК, осаждая этанолом, а затем растворяют в 24 мкл

TEN. 40 пмоль фосфорилированного 25

BamHI адаптерного фрагмента добавляют к 0,5 мкг (0,2 пмоль, концы) выжженной описанным выше способом плазмиды в 16 мкл лит аэного буфера, содержащего 2 ед. Т4 ДНК лигазы. Полученную смесь инкубируют в течение

2 ч при 22 С, 16 ч — при 4 С, а затем IO мин при 65ОС. BamHI липкий конец получают обычным выжиганием BamHI рестрикционным ферментом, фермент расщепляет линкерную последователь35 ность так же, тсак BamHI сайт, расположенный в начале клонированной кДНК последовательности человеческого гормона роста. Это дает 691Ьр фраг- 40 мент с липкими BamHI концами, который вьщеляют сначала на 6Х-ном полиакриламидном геле, а затем — обычным способом. Выделенный ДНК фрагмент лигируют (используя 0,2 ед. Т4 45

ДНК лигаэы в 20 мкл буфера в описанных ранее условиях) с 0,2 мкг BamHf, выжженной и обработанной щелочной фосфатазой pBR322. Спустя 16 ч при

4 C полученный материал используют для трансформирования Е.coli штамм

JA221/NRR7D-15014). Трансформанты отбирают на агарных пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, затем обычным способом вьщеляют плазмиды, и дентифицируют рестрикционным ферментом и анализируют с помощью гель-электрофореза. Целевые плазмиды, обозначенные,рММ575, содержат BamHI фрагмент (приблизительно 700Ьр), их размножают обычным способом для дальнейшего использования.

ДНК последовательность зрелого человеческого гормона роста содержит один FnuDII сайт, который составляет 47bp из первого нуклеотида.

25 мкг pNM575 выжигают в 250 мкл

BamHI буфера с 25 ед. BamHI npu

37ОС в течение часа. 691Ър фрагмент с BamHI липким концом обычным способом изолируют из 6Х-ного полиакриламидного геля и очищают. После очистки фрагмента одну треть его (эквивалент 8 мкл плазмиды) выжигают в 100 мкл FnuDII буфера (6 мМ

NaC1, 6 мМ Tris НС1, рН 7,4; 6 мМ

MgCla., 6 мМ Р-меркаптоэтанола) с

2,5 ед. FnuDII в течение 1,5 ч при

37 С. Электрофорез íà 6Х-ном полиакриламидном геле и стандартная методика выделения дают воэможность вьщелить 538bp ДНК фрагмент, содержащий кодирующую последовательность для последних 175 аминокислот гена с последующем трансляционным стопсигнапом.

Двухнитевой ДНК фрагмент синтезируют фосфотриэфирным способом для присоединения lрр промоторного участка с кодирующим участком гормона роста человека.

1491346

Получают следующие сегыечты:

j) CTAGAGGGTAT

2) TAATAATGTTCC

3) CATTGGATGAT

4) GATGATAAGTTCС

5) CAACCATTCCC

6) TTATCCAGGC

7) TTTTTGACAACG

6) Стдтсстссс

g) CATTATTAATACCC Т

10) ATGGGAA

11) СТТАТ САТ САТ С СА

12) (:сттсссАА

15) GGATAAGGGAAT

20

f4) GTCAAAAAGCCT

f5) СGGAGcATAGCGTт

Используя полученные описанным выше способом сегменты, реакцию присоединения, каталиэируемую Т4 лигазой, осуществляют поэтапно: а) 5 -нефосфорилированный сегмент 1 присоединяют к 5 -фосфорилиро-! ванному сегменту 2 в присутствии

5-фосфорилированного сегмента 9, используя Т4 лигазу для получения ДНК дуплекса 1. Дуплекс выделяют препаративным гель-электрофорезом на

15Х-ном полиакриламиде;

b) 5 -фосфорилированный сегмент

3 присоединяют к 5 -фосфорилирован- 40 ному сегменту 4 в присутствии 5 — фосфорилированного сегмента 11, используя Т4 лигазу для получения ДНК дуплекса 2, который очищают на 15Хном полиакриламидном геле с помощью 45 электрофореза; с) 5 -фосфорипированный сегмент 5 присоединяют к 5 -фосфорилированному сегменту 6 в присутствии 5 -фосфорилинованных сегментов 12 и 13, используя Т4 лигазу для получения

ДНК дуплекса 3, который очищают с помощью электрофореза íà 15Х-ном полиакрилакидном геле;

d) 5 -фосфорилированный сегмент 7 присоединяют к 5 -фосфорилированному сегменту 8 в присутствии 5 -фосфорилированного сегмента 14 и 5 -нефосфорилированного сегмента 15, используя Т4 лигаэу для обраэованив

JIHK л .плекса 4, которьпi очак ают электрофореэо.1 иа 152-ном полиакриламидном геле; е) ДПК дуплексы 2,3 и 4 сосдиняют затем вместе Т4 лигазой до образовàHèÿ ДНК дуплекса 5, KоторbIA очищают с помощью электрофореза на

15Х вЂ” ном полиакриламидном геле;

f) 5 -фосфорилированный сегмент

10 и ДНК дуплекс 5 добавляют в присутствии Т4 лигаэы к ДНК дуплексу 1. Полученный ДНК дуплекс очищают с помощью электрофореэа на

15Х-ном полиакриламидном геле. Затем ДНК дуплекс ферментативно фосфорилируют, используя Т4 полинуклеотидкиназу и (к ) АТР в соответствии с установленной методикой.

Экспрессионную плазмиду PNM702 конструируют ферментативным присоединением 0,1 пмоль (0,4 мкг) XbalBArnHI фрагмента плазмиды pKEN021, 0,025 пмоль синтетического ДНК фрагмента и 0,3 пмоль (0,08 мкг) 538Ьр фрагмента в 24 мкл лигирующего буфера, используя 1,5 ед. Т4 ДНК лигазы, После инкубирования в течение

16 ч при 4 С полученную смесь используют для трансформирования Е.со1 .

JA221, как было описано ранее.

Трансформанты отбирают на агарных пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и обычным способом культивируют в качестве предпочтительного источника целевой плазмиды экспрессии.

Экспрессию человеческого гормона роста определяют по стандартной методике радиоиммуноанализа. При определении она составляет по крайней мере, 2 мпн. молекул на клетку.

Плазмиду pNM702 экспрессии человеческого гормона роста используют в качестве исходного материала при конструировании плазмиды, экспрессирующей Met-Phe Pro-Keu-Авр-Asp-Asp-Asp-Jvs-ЬСН.

Плазмиду pBR348 используют в качестве источника двух фрагментов

ДНК, содержащих кодирунщую последовательность для части гена бычьего гормона роста. Плаэмида содержит

831bp бычий гормон роста — кодирующую последовательность, клонированную. в PstI рестрикционный сайт

pBR322.

10 мкг pNM702 частично выжигают

1 ед. PVUII в 00 мкл PVUII рестрик1491346

12 хна ю

5 CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGf l l t I I 1 f f f f t f t I I t t f f I I f f f t f f 1 f f l f f f l f I l

3 TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTC>I ДЯОИ

ТТCCCAGCCATGTCCTT GTC

1II 11II I I I 1 Ill l l l t I

1 AGGGTCGGTACAGGAACAGGC

1) C TAG ÑGGTÄT

2) TAATAATGTTCC

3) CATTCGATGAT

4) СйтаятМсттСС

5) CAGCCATGTCCTTGTC ционного буфера (60 иМ NaCl 6 мМ

Tris НС1, рН 7,5; 6 мМ MgClq, 6 мМ

Р-меркаптоэтанола) в течение 10 мин при 37 С. После прекращения реакции нагреванием в течение 10 мин при

65 С ДНК материал обрабатывают щелочной фосфатазой и выделяют фрагменты на 1Х-ном агароэном геле. Линейный ДНК фрагмент размера, соответствующего ДНК без 497Ьр PVUII фрагмента (выходит несколько раньше, чем плазмида с одним разрывом), обычным способом выделяют, очищают и используют при конструировании промежуточной плазмиды.

Фрагмент 494Ьр PVUII плаэмиды

pBR348 получают выжиганием 10 мкг плазмиды в 200 мкл pVUII буфера,, содержащего 10 ед. pVUII в течение часа при 37 С. Эти фрагменты выделяют на 6Х-ном полиакриламидном геле, целевой 494Ьр обычным способом проявляют и очищают. !

Промежуточную плазмиду конструируют, осуществляя взаимодействие

0,2 мкг плазмиды pNM702 PVUII Арагмента с 0,05 мкг 494Ьр фрагмента в

20 мкл Т4 ДНК лигаэного буфера, содержащего 2 ед. Т4 ДНК лигазы, в течение 16 ч при 4 С. После трансформации и селекции трансформантов на устойчивость к ампициллину плаэмиды обычным способом анализируют на присутствие и соответствующую ориентацию 494Ьр PVUII фрагмента. Плазмиды с 494Ьр PVUII фрагментом и 440Ър

KbaI-Small ôðàãìåíòîì отбирают для

При получении 63Ьр фрагмента приготавливают следуннчие 9 сегментов: использования при дальнейшем конструировании.

10 мкг промежуточной плазмиды выжигают 1 ед. PVUII в 200 мкл PVUII буфера в течение 5 мин при 37 С. После нагревания в течение 10 мин при

65 С полученную смесь распределяют на 17. — ном агарозном геле, выделяют

10 линейную ДНК, имеющую только один единичный PVUII разрыв на молекулу, и очищают. Выделенный материал (приблизительно 3 мкг) полностью выжигают

5 ед. XbaI и обрабатывают щелочной

15 фосфатаэой. Эти фрагменты распределяют на IX-ном агарознои геле, самый большой из них (потерявший 109bp фрагмент между XbaI и первым сайтом

PVUII в человеческои и бычьем гормо20 не роста) выделяют обычным способом.

ДНК последовательность для первых 23 аминокислот (69Ър) бычьего гормона роста до первого PVUII сайта содержит 2HpaII рестрикционных сайта, первый из которых расположен на 23Ър от первой нуклеотиды кодирующей последовательности. 63Ьр фрагмент синтезируют фосфортриэфирным способом. Этот первый фрагмент соот30 ветствует 19Ьр последовательности от

XbaI сайта в 1рр рибосомном связывающем сайте через АТС-трансляционный стартовый сигнал с последующей кодирующей последовательностью для Phe-Pro-Zeu-Asp-Asp-Аяр-АБр-Zys (24Ьр) и 20 нуклеотидаии кодирующей последовательности бычьего гормона роста (от Phe до первого HpaII сайта) и имеет следующую последовательность:

5) ATGGGAACATTATTAATACC CT

7),ГтАтсА ГсАтсAYС СА

8) ать(стасо я дс

g) Са@Д CAAGC Ac

Используя приготовленные ранее сегменты, осуществляют поэтапное присоединение, катализируя процесс Т4 лигаэой:

13! 491346 а) 5 -нефосфорилированный сегмент 1 присоединяют к 5 -фосфорилированному сегменту 2 в присутствии

5 -фосфорилированного сегмента 6

5 используя Т4 лигазу для образования

ДНК дуплекса 1, который очищают электрофорезом на 15Х-ном полиакрипамидном геле;

Ь) 5 -фосфорилированные сегменты

3,4 и 5 соединяют в присутствии 5 — фосфорилированного сегмента 9, используя Т4 лигазу для получения ДНК дуплекса, который очищают с помощью электрофореза на 15Х-ном полиакриламидном геле. Затем ДНК дуплекс ферментативно фосфорилируют, используя

Т4 полинуклеотидную киназу и (g )

ATP с последующей стандартной процедурой. 20

ДНК фрагмент 46Ър, который простирается от описанного HpaII сайта до PVUII сайта, можно сконструировать синтетически или получить из исходной pBR348 плазмиды; 100 мкл 25 плазмиды рВН348 выжигают в 400 мл

PVUII буфера (50 ед. PVUII) в течение 2 ч при 37 C„ После фенольной экстракции и осаждения этанолом ДНК растворяют в 400 мкл PstI буфера 30 (50 мМ На,l бмМ Tris НС1, рН 7,4;

6 мМ MgC1, 6 мМ Р-меркаптоэтанола1 с 50 ед. Pstl s течение 2 ч при 37оС.

ДНК фрагменты распределяют на 6Х-ном полиакрипамидном геле, 135 фрагмент, содержащий целевую 46bp последовательность, вьщеляют и очищают стандартными способами, Одну треть выделенной ДНК (эквивалентно 33 мкг) подвергают ограниченному выжиганию

1 ед. HpaII рестрикционного фермента в 100 мкл HpaII буфера (20 мМ Tris

« НС1, рН 7,4; 7 мМ MgC1 6 мМ -меркаптоэтанола) в течение 40 мин при 37 С. После нагревания при 65 С 45 в течение 10 мии ДНК фрагменты помещают на 5Х-ный акриламидный гель (акриламид .бис отношение 19:I) вместе с соответствующим маркером размера. Целевой 46bp фрагмент, по50 лученный Нрав? частичным выжиганием

135Ър фрагмента, очищают стандартным способом.

0,2 мкг XbaI-.PVUII фрагмента плаэмидного вектора, 3,2 пмоль синтетического 63Ър фрагмента и 0,5 пмоль

46bp фрагмента инкубируют в 10 мкл лигирующего буфера с 2 ед. Т4 ДНК лигаэы в течение 16 ч при 4 С, Лигирующую смесь использун т для рансф рмации Е.сoli JA221, Полученные трансформанты, которые содержат целевую плазмиду р11М789, отбирают на устойчивость к ампициллину. Идентичность с плазмидой pNM789 подтверждена обычным скринированием на наличие

494bp PNII и 109bp XbaI-PVUII фрагментов.

Плазмида рНМ789 требует изменения одного аминокислотного кодона для полного превращения в бычий гормон роста, что осуществляют удалением

28bp PVUII до BamHI фрагмента pNM789 и заменой синтетическим двухнитевым фрагментом, имеющим следующую последовательность:

5 CTGTGCCTTCTAC 3

3 GACACGGAAGATCCTAG 5

10 мкг рЯ1789 выжигают l ед.

PVUII в 200 Mrcsl PVUII буфера в течение 5 мин при 37 С. После нагревания в течение 10 мин при 65o C полученную смесь разбавляют до 300 мкл с добавлением BamHI буфера, выжигают до завершения 10 ед. BamHI в течение часа при 37 С, обрабатывают 5 ед. щелочной фосфатазы и инкубируют в тече- ние часа при 650C. jjHK фрагменты разделяют íà 1Х-ном агарозном геле; ДНК фрагмент размером плазмиды рКМ789 с единичным разрывом очищают обычным способом. 0,02 мкг этого фрагмента лигируют 5 пмоль синтетического фрагмента, используя.2 ед. Т4 лигаэы в

20 мкл лигазного буфера. Лигирование осуществляют в течение ночи при 4 С.

После трансформации несколько плаэмид вьщеляют и скринируют на соответствующие PVUII (494Ьр) и XbaIBamII (628bp) фрагменты. Плазмнды, содержащие указанные выше фрагменты, составляют целевую плазмиду рНМ789В.

Пример 2. Бактерию Е.coli

К12/pIM-II-АЗ/NRRI.Â-15733) культивируют в TV бульоне (1X триптона, 0,5Х дрожжевого экстракта, 0,5Х хло" ристого натрия; рН 7,4) с 90 мкг/мл канамицина при 25оС в соответствии с обычной микробиологической процедурой. После этого культуру разбавляют 1:10 в свежем бульоне, после трех часов инкубирования при 37 С 0,5 мл культуры переносят в 1,5 мл ампулу

Эппендорфа и центрифугируют в течение 15 с. Если нет других указаний, все манипуляции осуществляют при комнатной температуре. Полученную над1491346

16 осадочную жидк ость о сторожно удаляют аспиратором с острым концом. Клеточную массу повторно суспендируют в

&00 мкл свежеприготовленного лиэо5 цимного раствора (2 мкг/мл), который содержит 2 мкг/мл лизоцима, 50 мИ глюкозы, 10 мИ ЕТДА (диаминтетраацетат) и 25 мИ Tris НС1, рН 8. Добавляют ".200 мкл щелочного SDS (натрий- tp додецилсульфат) раствора (0,2 NaOH, 1Х SDS) и осторожно переворачивают ампулу, а затем выдерживают при 0 С до завершения лизиса (примерно

5 мин). Затеи добавляют 150 мкл 3 М натрийацетата и осторожно смешивают содержимое ампулы, переворачивая ее в течение нескольких секунд.

-Ампулу выдерживают при 0 С в течение по крайней мере 60 мин, а 20 затем центрифугируют в течение 15 мин до получения почти прозрачной надосадочной жидкости, Надосадочную жидкость переносят во вторую ампулу центрифуги, в которую добавля- 25

Ъ ют 3 объема холодного 100Х-ного этанола. После вьщерживання ампулы на смеси сухой лед — этанол в течение

5 мин полученный осадок собирают центрифугированием (5 мин), надоса- 30 дочную жидкость удаляют отсасыванием.

Собранную массу раствор1пот в 100 мкл

TE (10 мИ Tris. НС1 рН S 0; 1 мИ ЕДТА) .

Получают целевую ДНК р?М-1 -АЗ плазмиды. 35

Около 5 мкл плазмиды pNM789B .ДНК в 50 мкл HiSalt буфера инкубируют с 10 ед. каждого (BamHI и XbaI) рестрикционного фермента при 37 С в те- 40 чение 1 ч. После добавления 5 мкл

ЗИ ацетата натрия (рН 8,0) ДНК осаждают 3 объемами 100Х-ного этанола, Целевой ДНК диджест растворяют в

100 à ТЕ буфера и хранят при 0 С 45 для дальнейшего использования, 6АО 6АТ САТ ТАА АТЮ ТТС CCA gCC

Е ° Е Е ЕЕ ttl ЕЕ ЕЕЕ ЕЕЕ» ФФ1 ЕФЕ

CTC CTA CTA АТТ ТАС ААС ССТц CCL

ССС ААС GCT ЮТССТ Зе

tII III III I

CCr, ТТС CCA C S

5 СТЛСАСССТАТТЛАТА АТС ПИТТС, li t liltttttttttt ftl еЕI

3 7CCCATAATTAT ТАС AAC

АТ9 ТСС TTC TCC ССС СТС TTT

ТАС АСС AAC АСС CCC САС AAA

Целевую линкерную последовательность синтезируют обычным модифицированным фосфотриэфирным способом.

Около 200 пмоль ДНК линкера примера 3, 1 мкг плазмиды рСЕ101

Около 1 мкг выварки плазмиды

pIM-I -АЗ, 1 мкг выварки плазмиды

pNM789B XbaI-BamHI, 40 мкл воды, 5 мкл (5 мИ) АТП, 5 мкл лигирующей смеси и 5 ел. Т4 ДНК лигазы инкубируит при 20 С в течение 2 ч. После о" инкубирования при 65 С в течение

2 мин с последующим клонированием на льду полученную смесь лигирования используют для трансформации

К12КЧ308 Hà TV пластинах (1X триптона, 0,5Х дрожжевого экстракта, 0,5Х хлористого натрия, 1,5Х агара, рН 7 » содержащих 50 мкг/мл канамицина.

Некоторые из полученных трансформантов (что можно легко показать обычным электрофорезом на агарозном геле и другими тестами) содержат только целевую 10,8kb плазмиду.

Полученные клетки используют для выделения плазмиды pCZ101.

Пример 3. Целевой фрагмент конструируют практически по способу примера 2, за исключением того, что вместо плазмиды рНИ789В используют плазмиду рСЕ101. Целевой

10,2kb BamHI-ХЬаТ рестрикционный фрагмент обычным способом выделяют и изолируют с помощью электрофореза на агарозном геле, затем растворяют в 100 мкл ТЕ буфера и хранят при

О С для дальнейшего использования.

Целевой фрагмент конструируют по способу примера 2 за исключением того,. что вместо плазмнды pNM789B и XbaI рестрикционного фермента используют плазмиду pCZ101 и HgiAI рестрикционный фермент. Целевые 0,6kb BamHI-HgiAI рестрикционные фрагменты выделяют обычным способом с помощью электрофореза на агарозном геле, затем растворяют в 100 мкл ТЕ буфера и хранят при 0 С для Дальнейшего использования, 10,2kb BamHI-XbaI фрагмента и

0,5 мкг плазмиды рСЕ101 "-0,6kb

BamHI-HgiAI фрагмента лигируют, полученную плазмиду используют дпя

14913 »

17 тельность

ATG Ттс CCA ТТЬ GAT GAT GAT TAA ATG ТТС !

1!!!rrr!!!!!!!!!!r!r,!!!!!r.!!!

ТАС AAG GGT AAC СТА СТА СТА АТТ ТАС AAG

ТСС GGC CTG ттт GCC AAC ССТ GTGCT 3 ! !!! !!! !1! !!! rrr r!! r! rr !!!

AGG C CG САС ААА CGG ТТС CGA С 5

5 CTAGAGCGTATTAATA !!!!!!!!!!!

3 ТСССДТААТТАТ

ССА GCC ATG ТСС ТТС

rrr !!! rr! У!! !!

ИТ ССС ТАС AGG ААС трансформирования Е,coli К12 КЧ308 по способу примера 2.

Некоторые из полученных трансформантов (что легко показать с помощью электрофореза на агарозном геле и других тестов) содержат только целевую 10,8kb плазмиду. Такой трансформант, обозначенный E.coli

K12RV308/pCZ114, отбирают, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем культивируют в соответствии с обычными микробиологическими методиками. Как было показано с помощью SDS гель1

Целевые трансформанты, обозначенные Е.coli К12-RV308/pCZ101,1, помещают на TV агар, содержащий соответств нч ие антибиотики, а затем обычным способом культивируют. Выделяют плазмиду pCZ101,1. Как показано с помощью SDS гель-злектрофореэа, R1A и других тестов, траисформант;: осуществляют экспрессию met-bGH с высокими уровнями. Так как плазмида рСЕ101,1 содержит термоиндуцируемый репликон "ускоренного роста", мак- 35 симальная экспрессия met-bGH происходит при культивировании при температуре 37 С.

Пример 5, Плазмида pGMI содержит Е.coli триптофановый опе- 40 рон, содержащий исключение >ZE1413.

Следовательно, экспрессирует литый протеин, содержащий первые 6 аминокислот trp лидера и приблизительно последнюю треть trpE полипептида 45 (здесь и далее для краткости обозначаемого ZE ), а также trpD полипепг тид целиком (все под контролем trp промотор/операторной системы).

Около 20 мкг плазмиды выжигают рестрикционным ферментом PNUII, который расщепляет плазмиду по 5 сайтам. Генные фрагменты объединяют

EcoRI линкерами, состоящими иэ самокомплементарных лигонуклеотидов последовательности рСАТСААТТСАТС, обеспечивая EcoRI саит расщепления для последующего. клонирования в плаэмиду, содержащую EcoRI сайт. электрофореэа, kIA n других тестов, полученные клетки экспресспр<вали

met-bGH в болы и>м количс ство. Так как плазм . а р(;7.114 содержит тернов индуиированный репликон ускоренного роста, максимальная экспрессия тпег.ЬГН наблюдается при температуре выращивания культуры около 37 С.

Пример 4. Целевое конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 3 с тем отличием, что вмес1о линкерной последовательности примера3 используют последова20 мк г ДН К фра гмен то в, полученных из рСМ?, обрабатывают 10 ед.

Т4 ДНК лигазы в присутствии 200 пмоль

5 -фосфорилированного синтетического лигонуклеотида рСАТСААТТСАТС и

20 мкг Т4 ДНК лигазного буфера (20 мМ Tris, рН 7,6; 0,5 мМ АТР, 10 мМ MgClg 5 мМ дитиотретиола) при

4 С в течение ночи. Затем раствор нагревают в течение 10 мин при 70 С для остановки лигирования. Линкеры расщепляют EcoRI выжиганием, фрагменты (теперь уже с EcoRI концами) выделяют, используя 57.-ный полиакриламидный гель-злектрофореэ. Три самых крупных фрагмента выделяют иэ геля, вначале окрашивая этидиумбромидом, затем определяя положение фрагментов под действием ультрафиолетового излучения и выражая из ге-, ля участки, представляющие интерес.

Каждый из фрагментов геля с 300 мкл

0,1МТВЕ помещают в камеру для диализа и подвергают электрофорезу при 100 Р..в. течение часа в 0,1 хТВЕ буфере (TBE буфер содержит

10,8 г Tris основания, 5,5 г борной кислоты, 0,09 r Na EljTA в 1 л Н О).

Водный раствор выбирают иэ камеры. для диализа, экстрагируют фенолом, хлороформом и доводят до 0,2М по отношению к хлористому натрию. 3атем ДНК выделяют в воде после осаждения этанолом, Фрагменты, содержащие trp промотор/оператор с EcoRI липкими концами, идентифицируют пуl9

1491346

Отбирают несколько устойчивых к тетрациклину колоний, вьщеляют плазмидную ДНК и обозначают pBRHtrp.

Наличие целевого фрагмента подтвер- 45 ждается рестрикционным ферментным анализом, Плазмидный pBRHtrp экспрессирует -лактамазу, придает устойчивость к ампициллину и содержит

50 промо то р/оператор. ДНК фрагмент также кодирует, первый протеин (обозначенный ZE), содержащий "сшивку" первых шести аминокислот trp лидера и приблизительно последнюю треть

trpE полипептида; второй протеин (обозначенный D), соответствующий приблизительно первой половике trpD полнпептнда, и третий протеин, котем включения в чувствительную к тетрациклину плазмиду, которая после включения промотор/оператора становится устойчивой к тетрациклину,.

Все вьщеления ДНК фрагмента, описанные здесь и далее, в этом примере осуществляют с применением РАСЕ с последующим электроэлюированием, описанным выше.

Плазмида pBRHI экспрессирует устойчивость к амипициллину и содержит ген устойчивости к тетрациклину, но так как в ней нет связанного промотора, не экспрессирует эту устойчивость. Клетки, в которых находится плазмида, соответственно, являются чувствительными к тетрациклину.

Если ввести промотор/операторную систему в EcoRI сайт, плазмида будет экспрессировать устойчивость к тетрациклину.

Плазмиду рВКН? дигерируют Есор?.

Фермент, удаляют, экстрагируя фенолом, а затем хлороформом. ДНК повторно суспендируют в воде после осаждения этанолом. Полученную ДНК в отдельных реакционных смесях объединяют с каждым из трех ДНК фрагментов, полученных в примере 5, и лигируют с Т4 ДНК лигазой, как было описано ранее. ДНК, присутствующую в реакционной смеси, используют для трансформации компетентной Е.coli

К12294/NPPZB-15625/ с помощью, стандартной методики, затем бактерии помещают на пластины ЕВ, содержащие

20 мкг/мл ампициллина и 5 мкг/мл тетрациклина.

1О

40 дирующий ген устойчивости к тетрациклину.

Плазмиду pBRHtrp выжигают EcoRI рестрикционным ферментом. Полученный фрагмент, вьщеленный с помощью РАСЕ и электроэлюирования, объединяют с

EcoRI, выжженной плазмидой pSOMII.

Полученную смесь лигируют Т4 ДНК лигазой, полученную ДНК трансформируют в Е.cali K12 294, как было описано ранее. Трансформантную бактерию выбирают на пластинах, содержащих ампициллнн, Полученные колонии устойчивые к ампициллину, скринируют путем гибридизации. Фрагмент, содержащий trp промотор/оператор, вьщеленный из pBRHtrp, а затем меченный радиоактивно P" используют в вышеописанной процедуре в качестве зонда. Некоторые положительные при гибридизации колонии отбирают. Выделяют плазмидную ДНК. Ориентацию вставленных фрагментов определяют рестрикционным анализом, используя ферменты BgIII u BamHI в двойном выжигании. Колонии, содержащие целевую плазмиду с фрагментом trp промотор/ оператор в соответствующей ориентации, выращивают на ZB среде, содержащей 10 мкг/мл ампициплина. Целевую плазмиду обозначают рЯОМ7а2 и используют для последующих конструкций, описанных далее.

Плазмиду pSOM752 выжигают HindIII, а затем лямбда-экзонуклеазой (5 до 3 экзонуклеаза) в условиях, выбранных так, чтобы выжигание произошло позади BglII рестрикцнонного сайта внутри ZE кодирующего участка. Около 20 мкг HindIII выжженной рБОМ7Л2 растворяют в буфере (20 мМ глицин- ного буфера, рН 9,6; 1 мМ MgClg, 1 мМ -меркаптоэтанола). Полученную смесь обрабатывают 5 ед. лямбда-экзонуклеаэы в течение 60 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь, полученную при этом, экстрагируют фенолом, хлороформом и осаждают этанолом»

Для получения EcoRI остатка у дистального конца ZE генного фермента синтезируют праймер РССТСТССАТСАТ

32 усовершенствованным фосфотриэфирным способом и гибридизируют с однонитевым концом ЕЕ генного фрагмента, полученного при выжигании лямбдаэкэогенаэой. Гндридиэацию проводят, растворяя 20 мкг обработанного лямб2I

1491346

Олигодеоксирибонуклеотиды Т -Т, синтезированные модифипированным фосфотриэфирным способом, представлены в табл. 1.

55 да-зкзогеназой. Гибридизацию проводят, растворяя 20 мкг обработанного лямбда-зкзогеназой продукта выжигания

HindIII плазмиды рБОМ7Л2 в 20 мкл

Н О и объединяя с 6 мкл раствора, содержащего 80 пмоль 5 -фосфорилированного олигонуклеотида, описанного ранее. Синтетический фрагмент гибридизируют с 3 концом 7Е коди- 10 ( рующей последовательности, а остальную однонитевую часть ZF. фрагмента заполняют полимеразой Кленова I, используя dATP dTTP dCTP и dCTP, Полимераза Кленова I является фрагментом, полученным при протеолитическом расщеплении ДНК полимеразы I.

Она соде,ржит 5 — 3 полимернзующую активность, 3 — 5 экзонуклеотичесI ( кую активность, но не 5 -3 экзоI

20 нуклеотическую активность исходного фермента.

Затем реакционную смесь нагревают до 50 С и оставляют медленно остывать, после чего добавляют 4 мкл 25 фермента Кленова. После инкубирования 15 мин при комнатной температуре, затем 30 мин при 37 С реакцию останавливают, добавляя 5 мкл 0,25 М

ЕДТА. Реакционную смесь экстрагиру- 30 ют фенолом, хлороформом и осаждают этанолом. ДНК последовательно расщепляют рестрикционным ферментом

BgIII. Полученные фрагменты разделяют РАСЕ. Ауторадиограмма, полученная для геля, выявляет меченый P фрагмент ожидаемой длины приблизительно 470Ьр, который выделяют электроэлюированием. Фрагмент ZE /d/ имеет BgIII терминус и тупой конец, 40 кодирующий начало праймера.

Плазмиду рТЬюП конструируют путем включения синтетического гена тимозин-О(1 в плазмиду pBR322. Синтез тимозин-M 1 кодирующей ДНК включает 4 синтез и последующее лигирование 16 олиг онукле о тидов (Т -Т ь) me t . ATG включают по N-термонулу, 5 концы снабжают однонитевым липким концом для облегчения присоединения плазмид расщепленных EcoRI u BamHI. Как легко видеть, BgIII сайт в центре гена помогает анализу рекомбинантных плазмид.

Полностью защищенные тридеоксирибонуклеотиды 4 (85 мг, 0,05 ммоль) и 2 (180 мг, О,1 ммоль) деблокируют по 5 гидвоксилам путем обработки

27.-ным BSA в 7:3 (объем/объем) хлороформ/метанол (10 и 20 мп соответственно) в течение 10 мин прн О С.

Реакции останавливают, добавляя насыщенный водный бикарбонат аммония (2 мл), материал экстрагируют хлороформом (25 мл) и промывают водой (2 10 мл). Органические слои сушат (над сульфатом магния), концентрируют до небольших объемов (около 5 мл) и осаждают, добавляя петролейный эфир (фракцию 35-60 С). Бесцветные осадки собирают центрифугированием и сушат в иксикаторе в вакууме до получения 6 и 8 соответственно (каждый гомогенный) в помощью ТЬС на силикагеле.

Тример:.r 1 и 3 (270 мг, О, 15 ммоль;

145 мг, 0,075 ммоль) превращают в их фосфодиэфиры (5 и 7) обработкой смесью триэтиламин/пиридин/вода (1:3:1, объем/объем, 10 мл) в течение 25 мнн при комнатной температуре. Реагенты удаляют в роторном ис- парителе. Остатки сушат повторным выпариванием с безводным пиридином (3r10 мл) . Тример 8 (0,05 ммоль) и тример 7 объединяют с TPST (50 мг, 0,15 ммоль) в безводном пиридине (3 мл). Реакционную смесь оставляют в вакууме при комнатной температуре в течение 2 ч. Анализ TZC показывает, что 957 тримера 8 превращено в гексамерный продукт (визуализированный по определению ДИТ группы путем опрыскивания 10Х-ной водной серной кислотой и нагревания при 60 С).

Реакцию гасят, добавляя воду (1 мл).

Растворитель выпаривают в вакууме при пониженном давлении. После удаления пиридина совместным испарением с толуолом гексамер деблокируют по

5 положению 21-ным BSA (8 мл), как описано ранее для тримеров 4 и 2.

Продукт (10) очищают на колонке с силикагелем (Merkc 60 Н, 3,5>5 см) поэтапным градиентным элюированием смесью хлороформ/метанол (98:2—

95:5, объем/объем). Фракции, которые содержат продукт 10, выпаривают досуха. Аналогично тример 5 объединяют с 6. Полностью защищенный продукт непосредственно очищают на силикагеле, Последнее соединение деблокиру23 14913

I ют по 3 концу смесью триэтнламин/ пиридин/вода, как описано ранее до получения фрагмента 9.

Гексамеры 9 и 10 объединяют в безводном пиридине (2 мл) с TPSTe (75 мг, 0,225 ммоль) в качестве конденсирующего агента. После завершения реакции(4 ч, комнатная температура) полученную смесь выпаривают в роторном испарителе, а остаток хроматографируют на силикагеле. Продукт II (160 мг), полученный осаждением петролейным эфиром, оказывается гомогенным по данным TZC. Часть 15 соединения II (20 мг) в пиридине (0,5 мл) полностью деблокируют, обрабатывая концентрированной гидроокисью аммония (7 мл, 8 ч, 60С С), а затем обрабатывают в 80Х-ной ук- 20 сусной кислоте (15 мин, комнатная температура). После выпаривания уксусной кислоты твердый остаток растворяют в 4Х-ной водной гидроокиси аммония (объем/объем, 4 мл) и экстра- 25 гируют этиловым эфиром (Зс2 мл).

Водную фазу концентрируют до 1-2 мл, часть обрабатывают с помощью HPZC для очистки 12. Фракции, соответствующие основному пику, собирают 30 (прибл. 2 А з4 ед.) и концентрируют до 5 мл. Конечный продукт 12 обессоливают на Биогеле Р-2 (1,5 100 см), элюируя 20Х-ным водным этанолом, сушат досуха и повторно суспендируют в воде (200 мкл) до получения раствора Aggq ; — 10, Последовательность 12 подтверждена двумерным анализом последовательностей.

Полный тимоэин Ы 1 ген собирают 40 иэ 16 синтетических олигонуклеотидов. Микрограммные количества олигонуклеотидов от Т до Т количественно фосфорилируют (y ) — ATF в присутствии Т4 полинуклеотидкиназы до получения специфических активностей приблизительно 1 Ки/моль. Радиомеченные фрагменты очищают электрофоре" зом на геле (20Х-ный полиакриламид/

7N мочевина). Последовательности в элюированных фрагментах индетифи50 цируют двумерным электрофореэом (гомохроматографией) . Фрагменты Т и Т а оставляют нефосфорилированньии для уменьшения нежелательной поли55 мериэации во время последующих реакций лигирования. Эти олигонуклеотиды (2 мкг каждый) собирают в четыре группы иэ четырех фрагментов

24

Т4 ДНК лигаэой. Продукт реакции очищают гель-электрофорезом íà 15X-ном полиакрипамидном геле, содержащем

7М мочевины. Четыре выделенных продукта лигнруют вместе, реакционную смесь разделяют с помощью электрофореза íà lOX-ном полиакриламидном геле. Электроэлюируют ДНК в интервале размеров тимозин- Ы 1 гена (90105 пар оснований).

Плазмиду pBR322 (0,5 мкг) обрабатывают BamHI u EcoRI рестрикционными эндонуклеаэамн, фрагменты pasделяют электрофорезом на полиакриламндном геле. Больший фрагмент выделяют иэ геля электроэлюированием и последовательно лигируют с собранной синтетической ДНК. Эту смесь используют для трансформирования Е.co1i К12 294. 5Х трансформационной смеси помещают на ZB пластины, содержащие 20 мкг/мл ампицнллина. Четыре полученные колонии, устойчивые к ампициллнну, чувствительны к тетрациклину, что предполагает включение гена устойчивости к тетрациклину.

Анализ плаэмид из этих четырех колоний показал, что в каждом случае . плазмида, выжженная pTh 1, содержит

III сайт, не находящийся в самой

pBR322, что указывает на наличие тимозин- 1 гена, и фрагмент (приблизительно 105 пар оснований), полученный расщеплением BamHI/EcoRI.

Плаэмида рТЬ,А 1 содержит ген, определяющий устойчивость к ампициллину, и структуральный ген, определяющий тимозин-0 1, клонированный

I по его 5 кодирующей конец нити в

EcoRI сайт и по егб 3 концу в BamHI сайт. Ген тимозина содержит также

BgIII сайт, Для создания плазмиды, способной принять ZE /d/ фрагмент, ! подготовленный ранее, pThd 1 бып выюкен EcoRI с последующей реакцией полимераэы Кленова 1 с dTTP u dATP к тупым EcoRI остаткам. BgIII выжигание полученного продукта создает линейный ДНК фрагмент, содержащий ген устойчивости к ампициллину, и на его противоположных концах — липкий BglIII остаток и тупой конец.

Полученный продукт может быть рециркуляризован путем реакции с ЕЕ /d/ фрагментом, содержащим BdlIII липкий конец и тупой конец, в присутствии

Т4 лигаэы до получения плаэмиды

pTrp24. При этом EcoRI сайт воссоэ149134б

2Ь дают в положении, где проходит лигирование тупого конца.

Последовательное выжигание

pTrp24BgIII и EcoRI с последующим

РАСЕ и электроэлюированием приводит к получению фрагмента, содержащего кодоны для ZE /d/ полипептида с

BglIII липким концом и EcoRI липким концом, прилегающим к ГО 3 кодиру- 1р ющему терминусу. ЕЕ /d/ фрагмент клонируют в BglIII сайт плазмиды рБОМ7Ь 2 до получения ZE полипептид/самотостатин сшивочного" протеина, экспрессированного под контролем триптофан промотор/оператора, 16 мкг плазмиды рБОМ742 разбавляют в 200,мкл буфера, содержащего

20 мМ Tris (рН 7,5), 5 мМ MgC1, 0,027 Р40 детергента и 100 мМ NaC1, 2р и обрабатывают 0,5 ед. EcnRI ° Спустя

15 мин при 37 С реакционную смесь экстрагируют фенолом, хлороформом, осаждают этанолом и последовательно выжигают BglIII. Больший из получен- 25 ных фрагментов выделяют с помощью

РАСЕ, а затем электроэлюированием, Этот фрагмент содержит кодоны

"ЕЕ /р/" для проксимального конца

ZE полипептида, то есть того, кото- 30 рый расположен раньше BgLIII сайта.

Этот фрагмент лигируют затем с вышеуказанными ЕЕ /d/ фрагментами в присутствии. Т4 ДНК лигазы до получения плазмиды PSOM78 284, которая после трансформации в Е.coli К12 294 эффективно продуцирует "сшивочиый" протеин, состоящий из полностью реконструированного ZE полипептида и самотостатина под контролем трипто- 40 фан промотор/оператора.

Плазмиду pBR322 выжигают HingIII, выступающие HindIII концы выжигают

SI нуклеазой. Выжигание SI нуклеазой включает обработку 10 мкг

HindIII расщепленной pBR322 в 30 мкл

SI буфера (0,3 М NaC1, 1 мМ ZnCQ, 25 мМ ацетата натрия; рН 4,5), с

300 ед. SI нуклеазы в течение 30 мин при 15 С. Реакцию останавливают, добавляя 1 мкл 30cl нуклеазного стопраствора (0,8 М трис-основания, 50 мМ

ЕДТА). Полученную смесь экстрагируют фенолом, хлороформом, осаждают этанолом, а затем выжигают EcoRI, как.описано ранее. Фрагмент, полученный с помощью РАСЕ с последующим электроэлюированием, имеет EcoRI липкий и тупой концы, кодирующая нить последнего начинается с нуклеотида тимидина. Выжженный HindIII

SI остаток, начинающийся с тимидина, можно присоединить к BglIII остатку, обработанному полимеразой, поэтому плазмиду pSOM7A2, полученную в примере 5, выжигают BglIII, полученные BglIII липкие концы дважды обрабатывают полимеразой Кленова 1, используя все 4 деоксинуклеотидтрифосфаты, ЕсoRI расщепление полученного продукта с последующей обработкой РАСЕ и электроэлюированием маленького фрагмента дает линейный участок ДНК, содержащий триптофан промотор/оператор и кодоны ZE "проксимальной" последовательности, расположенной раньше BgIII сайта ("ZE /р/" ). Полученный продукт имеет EcoRI конец и тупой конец, полученный при заполнении BgIII сайта.

Однако BgIII сайт реконструируют, лигируя тупой конец с тупым концом указанного вьппе выжженного HindIII

SI фрагмента. Таким образом, два фрагмента лигируют в присутствии

Т4 ДНК лигазы до образования рециркуляризованной плазмиды рНКУ10, которая распространяется трансформацией в компетентные E.coli K12 294 клетки.

Устойчивые к тетрациклину клетки, содержащие рекомбинантную плазмидную рнКУ10, отбирают, а плазмидную

ДНК экстрагируют. После выжигания

BgIII u PStI с последующим выделением РАСЕ и электроэлюированием крупного фрагмента получают целевой линейный кусок ДНК с PStI u BgIII липкими концами. Этот ДНК фра:мент, полученный из рНКУ10, содержит источник репликации и поэтому пригоден к использованию в качестве компоненты при конструировании плазмиды рН17Д4А1, в которой оба гена, кодирующих trpZE (полипептидный "сшивочный" белок и устойчивый к тетрациклину контролируются trp промотор/ оператором.

Плаэмиду.PSOM762b,4, полученную в примере 5, подвергают частичному дигерированию EcnRI с последующим дигерированием PStI. Полученный фрагмент, содержащий trp промотор/ оператор, выделяют с помощью РАСЕ с последующим электроэлюированием.

Частичное выжигание EcoRI необходимо для получения фрагмента, который расщепляется рядом 5 концом. гена

1491346

28 самотостатина, но не был расщеплен

no EcoRI сайту, имеющему место между геном устойчивости к ампициллину и

trp промотор/оператором.

Устойчивость к ампициллину, потерянную прн Pstl отщеплении в гене устойчивости к ампициллину, восстанавливают путем лигирования с конечным рНКУ10 линейным производным ДНК, полученным ранее в примере 5.

В качестве первой стадии при конструировании гена, кодирующего первые 32 аминокислоты проинсулина, получают серию из 18 олигонуклеотидов, представленных в табл, 2.

Некоторые нуклеотиды используют для конструирования гена В цепи человеческого инсулина. Два нуклеотида (В51 и В10 ) включают HpaII u терминальные ВатНТ и EcoRI рестрикционные сайты. Терминальные сайты полезны для целей клонирования.

8 олигонуклеотидов Hl-HH ранее использованных для конструирования левой половины гена В цепи человеческого инсулина, содержат кодирующую последовательность для 1-13 аминокислот гена В цепи и дополниI тельный N-терминальный метионин.

Правую половину гена В цепи конструируют из олнгонуклеотидов В, В, В», В4, Bsв В, Ву, В в В и В„ лигированием, используя Т4 ЦНК лигазу. Полученный генный фрагмент кодирует В цепь человеческого инсулина и первый аргHHHH HocTHKOBoA Uenn. Hpall рестрикционный сайт включают в генную последовательность в тот же самый считывающий фрагмент,,расположенный так же, как HpaII сайт, в гене инсулина человека, После очистки лигированного генного фрагмента электрофорезом на полиакриламидном геле и элюировання самой большой полосы

ДНК фрагмент включают в HindIIIВашНТ расщепленную плазмнду pBR322.

Полученную плазмиду, обозначенную рВЗ, включают в E.coli К12 294 путем трансформации. Плазмида придает устойчивость к антибиотикам (ампициллину и тетрациклину) и, как обнаружено, содержит целевую последовательность нуклеотидов.

Два фрагмента 58 пар оснований

HindIII-BamHI фрагмент рВЗ и 46 пар оснований ЕсоКТ-HindIII фрагмент

pBHI лигируют для получения фрагмента, имеющего ЕсоКТ и BamHI концы.

55 Зтот фрагмент лигируют обычным способом в EcoRI u BamHI рестриктиронанную плаэмиду pBR322, Полученную плазмиду, обозначенную рТВ3, клонируют затем в Е.coli K12 294. После обычной амплификации н выделения плазмиду pIB3 выжигают EcoRI u HpaII до получения синтетического генного фрагмента, который кодирует N-терминальные проинсулиновые аминокислоты во главе с метионином. Синтетический ген выделяют обычным способом с помощью электрофореза на полиакриламидном геле.

Декануклеотид 18, который содержит как BamHI узнающую последовательность, так и 3 участок политимидиловой кислоты, содержащий приблизительно 20 остатков, синтезируют и используют для стимулирования AMV обратной транскриптазы для синтеза кДНК. Праймер получают, используя деоксинуклеотидилтрансферазу с 1 мкм

BamHI декануклеотидов в реакционном объеме 0,6 мл, содержащем 1,5

-4 10 мкмоль TTP. Реакцию ведут при

37 С в течение часа в буферной системе. Выделяют полиАмРНК (2,5 мкг) ткани инсулиномы человека и превращают в дважды скрученную кДНК (практически аналогичным способом). затем реакционный объем (80 мкл), содержащий 15 мМ Тг1з НС1 (рН 8,3 при

42 С), 21 мМ КС1, 8 мМ MgClg, 30 мМ меркаптоэтанола, 2 мМ праймера

dCCGGATCCGGTT

150 мкл, содержащем 25 мМ Tris НС1 (pH 8, 3), 35 мМ KCl, 4 мМ MgClq, 15 мМ -меркаптоэтанола, 1 мМ dNTPS и 9 ед. полимеразы Кленова Т. Полуо ченную смесь инкубируют при 15 С в течение 90 мин, а затем 15 часов— при 4 С. Осуществляют нуклеазное выжигание .- в течение 2 ч при 37 С, исо пользуя 1000 ед. S/Hóêëåàçè/.Äâóíèтевую кДНК (0,37 мгк) обрабатывают электрофорезом на 8Х-ном полиакрипамидном геле. ДНК фрагменты, крупнее чем 500 пар оснований, элюируют.

К 3 концам фрагментов добавляют остатки олигодеоксицитидиповой кис29

149134() лоты, используя терминальную деоксинуклеотидилтрансферазу. кДНК с RC концами отжигaYlT до pBR322, затем выжигают PstI рестрикционным фермен5 том и сшивают с деоксигуанидиловой кислотой, используя терминальную деоксинуклеотидилтрансферазу. Полученные плазмиды используют для трансформации Е.coli К 12 294. Полученные клетки помещают на ZB и ТЕТ среду.

Колонии, устойчивые к тетрациклину, но чувствительные к ампициллину, выделяют и скринируют по плазмидам, которые содержат три PstI рестрикционных сайта. Одна плазмида, обозначенная рН1104, содержит вставку из

600 пар оснований, дает ожидаемый

PstI рестрикционный тип и содержит

BamHI сайт между 3 полиА и полиСС, 20 введенными при получении кДНК.

Сегмент синтетического гена, кодирующий первые 31 аминокислоты проинсулина„ выделяют из 50 мкг плазмиды pIB3, используя рестрикционную 25 эндонуклеазу EcoRI и HpaII, как описано ранее. Первый фрагмент также содержит ATG последовательность для метионина вместо "предпоследовательностин проинсулина. 30

Сегмент гена кДНК, кодирующий аминокислоты 32-86, так же, как

I трансляционный стоп-сигнал и 3 нетранслируемый участок мРНК, выделяют из 40 мкг плазмиды pHII04, которую обрабатывают вначале BamHI, а затем HpaII рестрикционными ферментами. Эти фрагменты выделяют электрофорезом на полиакриламидном геле с последующим электроэлюированием. 40

Генные фрагменты соединяют, обрабатывая Т4 ДНК лигазой в 20 мкл лигазного буфера при 4 С в течение 24 ч.

Полученную смесь разбавляют 50 мкл

Н О, обычным способом экстрагируют 45 фенолом и хлороформом, а затем осаждают этанолом, Полученную ДНК обрабатывают BamHI и ЕсоРI рестрикционными ферментами для регенерации этих с тов и удале50 ния генных полимеров. Собранный проинсулированный ген выделяют электрофореэом на полиакриламидном геле и лигируют (используя Т4 ДНК лигазы) для ЕсоКТ и BamHI дигерирования плаэмид pBR322. Полученную ДНК используют для трансформации Е.coli К12 294, а затем полученные колонии скринируют по устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Плаэмида рН13, выделенная из одной из таких колоний, содержит целевой ген проинсулнна, который затем характеризуют с помощью анализа нуклеотидных последовательностей.

Полный ген проинсулина человека, включающий N-терминальный кодон, который кодирует метионин, выделяют из плазмиды рН13 обработкой EcoRI и BamHI рестрикционными ферментами.

Целевой фрагмент очищают с помощью гель-электрофореза, а затем лигируют (используя Т4 ДНК лигазу) с частичным диджестом плазмиды

pS0M7d254 PstI-FcoRI (получена в примере 5) и большим из PstI-BgIII фрагментов плазмиды рНКУ10 (полученной в примере 5), Затем 1 мкг полного гена проинсулина человека с EcoRI и BamHI концами, 4 мкг PstI-EcoRI (частичный) pSOM7 5254 фрагмента и около 1 мкг PstI-BBIII фрагмента рНКУ10 лигируют при 4 С в течение

24 ч, используя Т4 ДНК лигазу в лигирующем буфере. Лигированную ДНК смесь используют для трансформирования Е.coli К12 294, Колонии, которые растут как на ампицкплине, так и на тетрациклине, отбирают. Обнаружено, что они содержат целевую плазмиду pHI7$451 и экспрессируют протеин молекулярного веса, ожидаемого от слияния гр7Е-гроинсулина.

Плазмиду рН17Д4r 1, которая экспрессирует вьппеуказанный протеин, полностью характеризуют как по ДНК последовательности, так и по рестрикционным сайтам обоих включенных генов, а также по вектору.

Пример 6. Около 5 васг ДНК плазмиды рН 17Д4Л1, 10 мкл (10 Х) реакционного буфера, 80 мкл воды и

5 мкл (5 ед.) HpaI рестрикционного фермента инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Затем реакцию гасят, инкубируя при 70 С в течение 5 мин, Смесь охлаждают на льду, добавляют около 12 мкл IM Tris НС1 (рН 7,2), 7 мкл воды и 1 мкл (10 ед.) EeoRI рестрнкционного фермента, Полученную смесь инкубируют вначале при 37 С в течение часа, а затем при 70 С в течение 5 мин. После охлаждения льдом полученную ДНК зкстрагируют фенолом и смесью хлороформ: иэоамиловый спирт (24:1), а затем осаждают этанолом. Целевой - 253bp EcoRIHpaI фрагмент обычным способом вы1491 346

III reit J I

ССА С Ю

55 деляют электрофорезом на полиакриламидном геле с электроэлюированием и осаждают ЕТОН, затем растворяют в 10 мкл ТЕ буфера и хранят при

О С до дальнейшего использования. 20 мкг ДНК плазмиды рН17д4д1 в

32 мкл (51) EcoRI реакционного буфера, 198 мкл воды и 4 мкл EcpRI рестрикционного фермента (20 ед.) инкубируют в течение приблизительно часа. Затем реакцию заканчивают инкубированием при 70 С в течение 5 мин.

Полученный 862bp EcoRI фрагмент выделяют электрофорезом íà 6Х-ном полиакриламидном геле с последующим электроэлюированием и осаждейием этанолом. Затем фрагмент растворяют в

" 100 мкл HpaI буфера, содержащего

16 ед. HpaI рестрикционного фермен- 20 та. После 1,5 ч инкубирования при

37 С добавляют 7,5 ед. TagI рестрикционного фермента, инкубируют в течение еще одного часа, полученные фрагменты выделяют обычным способом 25 на 7,5Х-ном полиакриламидном геле.

Целевой 34Ьр HpaI-TagI фрагмент выделяют электроэлюированием и осаждением этанолом, а затем растворяют в 5 мкл ТЕ буфера. 30

5 мкг ДНК плазмиды pBR322, 10 мкл

ClaC реакционной смеси, 77,5 мкл воды и 7,5 мкл (15 ед,) ClaI рестрикционного фермента инкубируют при

37 С в течение -1 ч. Затем реакцию заканчивают, инкубируя смесь,при

70"С в течение 5 мин. Смесь охлаждают на льду и добавляют около

12 ° 5 мкл 1М Tris НС1 (рН 7,2), 6,25 мкл 1М NaC1, 2,5 мкл 0,1М MgC1 40 и 1 мкл (10 ед.) EcoRI рестрикционного фермента. Полученную смесь ин5 сСАсА ATG ттс ссА тть GAG с4т

I fI ffI lfI I Il 1fI tll IIl

Л TGT ТАС АЛС GGT ААС CTA СТА

TGc ттс тсс GGc cTG ттт ссс ллс

111 I I I I II III (Р1 III III ФУ!

AGG AAC AGG CCG GAC ААА ССС TTG

Целевую линкерную последовательность синтезируют модифицированным фосфотриэфирным способом (указанный синтез конкретно иллюстрирован в примере 1).

Около 20 пмоль линкера ДНК примера 7; 1 мкг pNC608 диджеста, примера 7; 0,5 мкл плазмидного pCZ101

10,2kh ВяиН?-егоRI фрагмента (покубируют вначале при 37 С в течение

1 ч, а затем при 70 С в течение

5 мин. После охлаждения на льду полученную ДНК обрабатывают электрофорезом на 1Х-ном агарозном геле.

Крупный фрагмент выделяют элюированием и осаждают этанолом, затем растворяют в "20 мкл TE буфера и хранят при О С до дальнейшего использования.

Около 0,2 мкг 253bp EcoRI-HpaI фрагмента и 0,5 мкг HpaI-TagI фрагмента примера 6 и 0,1 мкг EcoRIG1aI диджеста примера 6 лигируют и используют для трансформации Е.coli

К12 RV308.

Часть полученных трансформантов, как показано с помощью электрофореза

Ф на агарозном геле и других тестов, содержит только целевую "4,6kb плазмиду. Такой трансформант, обозначенный Е.coli K12PV308/pNM608, отбирают, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем культивируют, используя обычные микробиологические методики. Плазмида

pNM608 является предпочтительным источником -287Ьр EcoRI-ClaI/TagI/ фрагмента плазмиды pH7) 4Я 1.

Пример 7. Около 5 мкг ДНК плазмиды pNM608 в 50 мкл Medium Salt буфера инкубируют с 10 ед. каждого из рестрикционных ферментов EcoRI и ClaI при 37 С в течение 1 ч. После добавления 5 мкл 3 И ацетата натрия (рН 7,0) ДНК осаждают 3 обьемами

1О0Х-ного этанола. Целевой ДНК диджест растворяют в 100 мкл ТЕ буфера и хранят при О С до дальнейшего использования.

GAT TAA AY& TTC ССА GCC АТЮ

cTA ATT TAG AAG GGT са6 тла лученного в соответствии с методикой примера 2, эа исключением того, что используют EcoRI и соответствующий буфер вместо Xbal рестрикционного фермента и буфера), 1 мкг плазмиды pCZ101 0,6kb ВашНТ-HgiAI фрагмента примера 2 лигируют, полученную плазмиду используют для трансформации Е.coli K12RV308.

1 - 9 1 3 6

3-4

55 CGACA ATG ТТС CCA TTG СДТ Ит GAT TAA Ать ттС ССА GCC Атб

555 rrr rrt rrt rrr r rrr rtr rrt Еrt ttr rrr ЕЕr rЕr

Л TGT TAC ААС COT AAC CTA СТА СТА ATT TAC AAG GGT CGG ТАС

ТСС TTG ТСС CGC CTG TTT GCC ААС GCT GTGCT Л

frf rrr rrI ttt tfr trt 5 ее е lr rrr r

AGG AAC ACG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C

5 C GACC ATG GAT CAG GAG TAA ATG TTC CCG GCT ATG ТСС ТТС

trt trrrtrrrr)55еееее(ееееееrrrrrr5 tI rrI

З ТСС TAC СТА GTC СТС ATT ТАС AAG СВС CGA ТАС AGG ААС

ТСС ССС СТС ТТТ GCC AAC GCT GTGCT 3

5 Ir 515 ее 5 еее 5 ее е ее еее е

AGG ССВ GAG AAA ССС ттС CGA С

Так как плазмида pCZ106,1 содержит термоиндуцируемый репликон "быстрого роста", максимальная экспрессия metbGH наблюдается при культивировании при температуре около 37 С. о

Часть полученных трансформантов, что удобно показать с помощью электрофореза на агарозном геле и других тестов, содержит только целевую 10,8kb плазмиду. Такой трансформант, обозначенный Е.coli К12РЧЗОЯ/pCZ105,1 отбирают на TV arape, содержащем соответствующие антибиотики, а затем культивируют, используя обычные микробиологические методики. Полученные клетки, как показано SDS гель-электрофорезом, RIA и другими тестами, экспрессирует met - в GH в больщих

Указанную вьппе определенную линкерную последовательность конструируют в соответствии с обычной методикой.

Целевые трансформанты, обозначенные E.coli K12RV308/pCZ105,2, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем обычным способом культивируют для производства и выделения плазмиды

pCZ105,2. Эти трансформанты, как показано с помощью SDS электрофореза, Конструируют указанную линкерную последовательность. Целевые трансформанты, обозначенные Е.coli

K12RV308/pCZl06,1, помещают íà TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем культивируют обычным способом для последующего получения и выделения плаэмиды

pCZ106,1. Эти трансформанты, как показано с помощью SDS гель-электрофореза, PIA и других тестов, экспрессируют met bGH с высокими уровнями. количест1 ах. Твк клк пдаз.1впа рС/.! 05, 1 содер: ит термоввдупврусмый pc пликон

It 1! быстрого роста, максимальная экспрессия met-ЬГ11 происходит при температурах культивирования около 37"С.

Пример 8, Целевые конструкции получают в соответствии со способом по примеру 7 с тем лечь отличием, что вместо линкерной последовательности примера 7 используют следующую ДНК линкерную последовательность:

RIA и других тестов, экспрессируют

met-bGH с высоким уровнем. Так как плазмида pCZ105,2 содержит термоиндуцируемый репликон вбыстрого роста", максимальная экспрессия metbGH наблюдается при культивировании о при температурах около 37 С.

Пример 9. Целевое конструи" рование осуществляют по способу примера 7, но вместо лннкерной госледовательности примера 7 используют

ДНК последовательность

Пример 10. Целевое конструирование осуществляют практически в соответствии со способом примера 7, но вместо линкерной последовательности примера 7 используют последовательность ДНК

1 491 346

36

5 ССЛСС ATG САТ САТ ААС ТАА ЛТС ТТТ CCG GCT ATG ТСС ТТС

ll! I tI ! 111 I II I i i 1! !1! I I I 1! I I I I f !

3 TGG ТАС СТА СТА TTC АТТ ТАС AAA GGC CGA ТАС AGG ААС

ТСС GGC СТС TTT ССС AAC GCT GTGCT 3

fi! fI! !!! !!! !т! If! )!!

AGG CCG GAG AAA CGC ТТС ССА С f

10 экспрессируют met-bGH с высокими уровнями. Так как плазмида pCZ112,1 содержит термоиндуцируемый репликон

11 11 быс тро го роста, максимальная эк11 спрессия met-bGH наблюдается при культивировании при температурах около 37 С.

Пример 11 Целевое конструирование осуществляют в соответствии со способом примера 7, но вместо линкерной последовательности примера 7 используют ДНК последовательность

5 CGACC ATG GAT GAT ААС GAG ТАЯ АТС TTT ССЬ ССТ ATG TCC

У тВС ТАС СТА СТА ТТС СТС ДСС ТАС ЯЯЯ CGС CССа ТАС АСа

TÒÑ ТСС GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT Ю

ААС AGG ССС САС AAA СбС TTG ССА С 8

Конструируют указанную линкерную последовательность в соответствии с обычной методикой.

Целевые трансформанты, обозначенные Е.coli K12RV309/pCZ112,2, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем обычным способом культивируют до получения и выделения плазмиды pCZ112,2. Эти трансформанты. как показано по дан- 40 ным гель-электрофореза, RIA и других тестов, экспрессируют met-bGE1 с выGAG. GAT ТАА ATG ТТТ ССТ GCT

° ° У 5!! ff !ГТ ff f. Iif tft

СТС. СТА АТТ ТАС ААА CGA CiGQ

4AC GCT CTrCT 3

ФУ! !!!

TTG CGA С У

5 CTAGAGGGTATTAATA..1.!!III! f! !f1!

3! TCCCATAATTAT

ATG ТСС ТТ& TCC CGC

f! f !! !! ) ! !! тЛС АИ AAC AGG CCC

ATG PATT GAG !

Фf f! f. ВУ!

ТАС .СТА GTC

CTG ТТТ GCC !!! !!! If)

СЛС АЯА CGG

Конструируют указанную вьппе линкерную последовательность в соответствии с обычной методикой.

Целевые трансформанты, обозначенные здесь Е.coli K12RV308/pCZ112, помещают Hà TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем обычным способом культивируют для последующего получения и вьщеления плазмиды pCZ112,1. Эти трансформанты, как показано с помощью SDS гельэлектрофореза, RIA и других тестов, !

Конструируют указанную вьппе линкерную последовательность в соответствии с обычной методикой.

Целевые трансформанты, обозначенные К.coli K12RV308!рСЕ1000, помещают íà TV агар, содержащий соответ-, ствующие антибиотики, а затем обычным способом культивируют для получения и яьщеления плазмиды pCZ1000. сокими уровнями. Так как плаэмида

pCZ112,2 содержит термоиндуцируемый репликон "быстрого роста", максимальная экспрессия met-bGH происходит при температуре культивирования около 37 С.

Пример 12. Целевое конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 3, заменяя линкерную последовательность примера 2 на ДНК линкерную последовательность

Эти трансформанты, как показано по данным гель-электрофореэа, RIA u других тестов, экспрессируют metbGH с высокими уровнями. Так как плазмида pCZ1000 содержит термоиндуцируемый репликон "быстрого роста", максимальная экспрессия происходит при культивировании при температурах около 37 С.

1491 346

Пример 13, Целевое конструирование осуществляют практически в соответствии со способом примера 3, за исключением того, что вместо линкерной последовательности примера 3 испольэуит 11НК линкерную последовательность

5 СТАСАСССТАТТААТА ATG GAT CAG TAA ATG ТТТ CCG ССТ АТС ТСС

ttstsstssttt rsr rrr rtt stt sst st»rs tst ttt вее

3 TCCCATAATTAT TAC CTA GTC ATT TAC AAA GGC CGA TAC АСС

ТТС TCC CCC СТС TTT ССС AAC GCT СТССТ 3 е те t sf т ее ее в т ее те т ° т т тат т

AAC АСС GC& GAC AAA ССС TTG CGA С 5

CTAGAGGG7ATTAATA ATG САТ GAT AAG ТАА ATG ТТС ССА ССС АТС е еееаееетееее еее еее еее ttt «s tst еее еее ttt eee

3 TCCCATAATTAT TAC СТА СТА ТТС ATT TAC AAG ССТ CGG ТАС

TCC ттС ТСС GGC СТС ТТТ ССС AAC GCT СТССТ Зе

ttt tt t eee ttt еат ете rrr втт ттт r

AGO AAC АСС CCG GAC AAA CGG ТТС ССА С 5

Конструируют указанную вьппе лин- сокими уровнями. Так как плаэмида керную последовательность в соответ- pGZ 1000 содержит термоиндуцируемый ствии с обычной методикой. 35 репликон "быстрого роста", максимальЦелевые трансформанты, обозначен- ная экспрессия происходит при кульные здесь E.coli K12RV308/pCZ)060, тивировании при температуре около помещают на TV агар, содержащий сост- 37 С. ветствующие антибиотики, и обычным Пример 15. Целевое конструспособом культивируют для получения 40 ирование осуществляют в соответствии и выделения плазмиды pCZ.1060. Эти со способом примера 3, но вместо трансформанты, как показано по дан- линкерной последовательности применым гель-злектрофореза, КТА и других ра 3 используют ДНК линкерную послетестов, экспресснруют met-bGH с вы- довательность

5е CTAGAGGGTATTAATA ATG &AT &AT AAG TAA ATG ттт CCG GCT ATG

t ее ее е а т т е е е е ее т r sr st t r sr sr s тат е ее r sr t st

iт TCCCATAATTAT TAC СТА СТА ТТС АТТ ТАС ААА GGC CGA TAC

ТСС TTG TCG GGC CTG TTT ССС ААС ССТ GTGCT З

ttt tsl eea sll rtt lit е та е

AGG AAC AGG CCG САС AAA ССС TTG CGA С 5

Конструируют указанную вьппе лин- виРУют длЯ полУчениЯ и выделекерную последовательность по обычной ниЯ плазмиды PCZ))20 Эти тРан методике.. сформанты, как показали данные

Целевые трансформанты, обозна- гель-электрофореза, RTA и друченные здесь Е.coli K)2RV308/РСУ))20, гих тестов, экспРессиРУют птеС-bGH помещают на TV агар, содерткащий с высокими уровнями. Так как плазмисоответствующие антибиотики, а да рС21120 содержит термоиндуцируезатем обычным способом культи- мый репликон "быстрого роста", макКонструируют указанную вьш е линкерную последовательность в соответ- 15 ствии с обычной методикой, Целевые трансформанты, обозначенные здесь Е.со1) К)2РЧ308/рГ7.1000,1, помещают на YV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем 20 обычным способом культивируют для последующего получения и выделения плазмиды pCZ)000,). Эти трансформаторы, как показали данные гель-электрофореза, RIA и других тестов, экспрес- 2 сируют met-bGH с высокими уровнями.

Так как плазмида pCZ1000 содержит термоиндуцируемый репликон "быстрого роста", максимальная экспрессия metbGH происходит при культивировании при температуре около 37ттС.

Пример 14„ Целевое конструирование осуществляют в соответствии со способом примера 3, используя вместо линкерной последовательности примера 3 ДНК линкерную последовательность

1491346

39 тов при 37 С в течение 1 ч. После добавления 5 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 7,0) ДНК осаждают 2 объемами

100 -ного этанола и выделяют. Целевой ДНК диджест растворяют в 100 мкл

TE буфера и хранят при ООС до дальнейшего использования„

5 CTAGAGGGTATTAATA ATG ТТС CCA TTG GAG GAT GAT ТАА АТС ТТС л тсссАтААттАт тАс AAG сст AAc cTc стА стА Атт TAc AAG

CCA ACC ATT ССС TTA ТСС AGO СТТ TTT САС ААС ССТ АТС СТС CG 3

f11 l11 1t t 11Е 111 111 еff 111 111 tft 111 tlt 11Е Е11 11

GGT TGG ТАА GGG AAT AGG TCC GAA ААА Cl С ТТС CGA TAG GAG GC 5 спрессия met-bGH происходит при культивировании при температурах около

37 С.!

Формула изобретения

5 CTAGAGGGTATTAATA ATG TTG GAG GAT GAT ТАА ATG ТТС CCA

111 1! 1 тсссАТАдттАТ TAc AAc стс сТА стд Атт TAc AAG GGT

ССС ATG TCC TTG ТСС GGC CTG TTT GCC ААС GCT GTGCT 3

ill t f f 1t l tl I Il I fit 111 I fl ill !1(1 tl 1

cGG тАс AGG ААс Асб ccG GAc AAA с&С TTG ссА с 5, И/1И стАсАьсстАТТАата ATG ттс ссА ттс окт пят оят тАА Атс ттс

1111 ttlt 1111 111 lft 111 III t If 111 tft 111 Ift. 111

TCCCATAATTAT TAC AAG GGT AAC CTA CTA CTA ATT TAC AAG симальная экспрессия г еС-bGH происходит при температурах около 37 С.

Пример 16„Около 5 мкг плаэмиды pNM575 (полученной в приме5 ре 1) в 50 мкл Medium Salt буфера ннкубируют с 10 ед. каждого (BamHI и FnuDII) иэ рестрикционных ферменКонструируют указанную вьппе линкерную последовательность в соответствии со способом синтеза, конкретно проиллюстрированным в примере 1. 20

Лигирование и трансформацию осуществляют следующим образом.

Около 20 пмоль ДНК линкера примера 16, 1 мкг BamHI-FnuDII диджеста примера 16 и 0,5 мкг ".10,2kb BamHIXbaI фрагмента примера 3 лигируют и используют полученную плазмиду для трансформации Е.coli K(2RV308 в соответствии со способом примера 2.

Часть полученных трансформантов, как показано с помощью электрофореза на агароэном геле, содержит только целевую 10,8kb плаэмиду. Трансформанты, обозначенные здесь E.coli

К12RV308/pCZ21140, отбирают, помещают на ТЧ агар, содержащий соответствующие.антибиотики, а затем культивируют, используя обычные микробиологические методики. Полученные клетки, как показали данные SDS гель- 40 электрофореэа, RIA и других тестов, экспрессируют met-ЬСН с высокими уровнями. Так как плаэмида pCZ1140 содержит термоиндуцируемый репликон и быстрого роста, максимальная эк- 45

1. Способ получения рекомбинантной плаэмидной ДНК, кодирующей синтез бычьего или человеческого гормона роста, путем объединения фрагментов ДНК, кодирующих липопротеиновый промотор, область инициации транскрипции, стартовый кодон трансляции, гормон роста и стоп-сигнал трансляции, отличающийся тем, что, с целью повьппения вывода метионинового гормона роста, объединяют BamHI-XbaI или BamHI-EcoRI фрагменты плазмиды pCZ101 размером около 10,21сЪ, включающие рекликон, утрачивающий контроль числа копий при 37 С, и липопротеиновый промотор Е.coli, причем плаэмиду pCZ101 получают лигированием XbaI-BamHI фрагмента плазмиды pIM-I АЗ размером около 10,2kb с XbaI-BamHI фраг- ментом плазмиды pNM789b и синтетическим линкером следующей нуклеотидной последовательности:

1 491 346

41

AAC GCT GTGCT У

11 l I I

TTG ССА С S, ÈËÈ

CCA &СС ATG TCC TTG

trr t tl t ti trr

GGT CGC тАС AGG AAC

ТСС

l I 1

АСС

GGC CTG TTT ССС

1)1 tti rll ttt

CCG GAC AAA C0G тАА Атс ттт ссТ

) t t rt r t) I 111

АТТ TAC AAA ССА

5) С TAGAGGGTATTAATA

1!111)) 1)

ТСССАТААттАт

A ò0

111

ТАС

GAT CAG ОАС САТ

I 1I i l r I I I II I стА 07С CTС CTA

AAC OCT GTGCT 3

It! 1

ТТС CGA C 5", или

ATG TTT CCG GCT ATG

I Ii lit 111 11 t ii

ТАС ААА GGC CGA TAG

ТТТ GCC ! l l I1)

AAA CGG

ССС

I l l

ССС

CTG

11 t

GAC

CAC ТАА

1l f I If

6ТС Атт

АТС

В li

ТАС

GAT

1t1

СТА

ААС GCT GTGCT 3

)!! тт0 CGA С Sl ИЛИ

ТСС TTG ТСС 66С CTG

t i I 1 ! f i i t t i I t I

AGG ААС AGG CCG CAC

GCC

t 1

ССС

TTT

f I

ААА

GAT

tit

CTA

5 CTAGACCCTATTAATA

I II I !1! 1111

TC С САТААТ ТАТ

GAT AAG ТАА ATG TTC CCA GCC

Itl 11! tl I 1!! lit 111 llf

СТА TTC АТТ ТАС AAG GGT CGG

ATG

11

ТАС

ATG тсс тт0 Tcc GGc стG ттт Gcc ААс сст GTGcT l1) 11) 11 1 )В! I 1! 111 1)1 11 1 ttf III

ТДС AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C

S, HËÈ

GAT AAG ТАА Атб ТТТ CCG GCT

Ill 11! 111 11! 1 !1 tf I ffr

CTA Ттс Дтт TAC AAA CCC ССА

5 CTAGAGGGTATTAATA

111 ) 11111 r I I

ТСССАТЛАттдт

GAT

111

СТА

ATC

I I 1

ТА С

ATG ТСС TTG ТСС GGC CTG ТТТ GCC ААС GCT GTGCT

1I I ВВ) )!В I)I III IВ! )11 111 )В! !11 I

TAC А&0 ААС AGG ССС САС AAA CGQ TTG CGA С

CCA TTG GAG GAT GAT

111 111 11! III 111

GGT AAC CTC CTA CTA

5 CTAGAGGGTATTAATA

11111!111!1!

Т СС С ATAATTAT

ТТС

tf t

AAG

ATG ! 11

ТАС

AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATC CTG

В)1 IIВ 111 Ill )11 Вtt Il) lll тсс GAA ААА cTG TTG CGA тАс GAC

ТСС

t l l

AGG

ТТС ССА ACC АТТ ССС

111 111 ill !1! tlt

AAG GGT ТЬЬ ТАА GGG

ТТА

I 1I

AAT

CG 3

tf

GC ) амикокислотных остатков человечес кого гормона роста, 2, Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что к рекомбинантной ДНК дополнительно присоединяют EcoRI-Clal фрагмент плазмиды

pNM608 размером 0,29kb, включающий с BamHI-Pnull фрагментом плаэмиды

pNM575 с кодоном, инициирующим трансляцию, стартовым кодОном, сайтОм 55 связывания пептида и рибосомы, стопсигналом трансляции и ходоками первых 14 аминокислотных остатков бычьего гормона роста или первых 15

CcT ATG тсс TTG тсс

It I )lI 1! В 111 f ll

CGA ТАС AGG ААС АСС

5 CTAGAGGGTATTAATA

11 I 111 I I I

Т С С СА TA АТТАТ

5, ИЛИ

Ф

raA АТЬ

1 11 I t)

АТТ ТАС

1491346

44 приследующую нуклеотидиую последовательность:

ATG тсс TTG тсс GGc GTG ттт Gcc AAc GcT стсст еrr tlr rrr rtr rtt rrr еrr lеl

ТЯС AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C

5, ИЛИ

5 cGAcA Атс ттс ccA TTG GAT GAT GAT TAA ATG TTG ссд Gcc

11 В I II I II 111 ЕЕ ЕIЕ I I I 111 I I I 111 I I I Ill 11! тот тдс ддс сст ААС стА стА стА Атт тАс ААс ост сьс

Атс тсс ттс Тсс ссс cTG ттт Gcc AAc GGT GTGGT 3 вее еее вев вев !ее еее евв еев !ее 111 в

TAC AGG AAC AGG CCG GAC ААА CGG TTG CGA С 5, ИЛИ

5 CGACC ATG GAT CAG GAG TAA ATG ттС CCC сст ATG тсс

111 еве е 11 111 111 еве ее! ttt trt tlt вее вве

TGG ТАС СТА GTC СТС ATT TAC AAG GGC С&А ТАС AGG

Зе тт Р Тс С СС С стС ттт GCC AAC сст стсст

Ill it I 1 1 1 ЕЕ r r ! е r r ее! r Е r e

ААС АСС CGG GAG AAA СОС TTС ССА С

5, ИЛИ

5 ССАСС ATG GAT GAT ААС TAA ATG ТТТ CCG GCT ATG TCC

III I1I

TGG TAc стА GTA ттс Атт TAc AAA GGc ссд тдс Асс

TTG ТСС GCC CTC Ттт GCG AAC GCT GTGCT 3

111 1!1 111 I tt !11 111 111 111 1

ААС АСС ССС GAG AAA CG& TTG CGA С 5 ИЛИ

5 CGACC АТЬ GAT GAT AAG GAG TAA ДТ6 ТТТ CCG CCT ATG

111111 tll еее-ее!в-ее! II .Itt lrl lit е!е lll

TCG ТАС СТА СТА TTC СТС АОС ТАС AAA GGC CGA TAC

TCC TTG Т СС GGC СТС ТТТ GCC AAC GCT GTGCT 3

111 1l I 111 lll Ill Ill tf1 111 Ilt 1

AGG ААС АСС ССС САС AAA CGG ттС CGA.С 5

Таблица 1 т, А-А-Т-Т-С-А-Т-С-Т-С 10 7.4 т Т-С-А-Т-С-С-Т-С-С-Т-С-Т-Т-С-А 15 24.3

43 триптофановый промотор Е.coli, чем синтетический линкер имеет

5 CGACA АТС TTC CCA TTG!

В! llr Еве Евв Еве

TGT TAC AAG GGT AAC

GAG САт GAT TAA ATG TTC ССА ССС

Ir I Ir I

СТС СТА CTA Дтт TAC ААс сст сои.45

149l 346

Т-А-С-Т-Т-С-Т-Т-С-Т-С-А

С-А-Т-Т-А-С-Т-А-С-Т-А-А-А

С-С-А-G-С-А-Т-С-А-С-А-С-А-Т-С

G-А-А-С-Т-А-Т-С-А-А-С-А

А-С-Т-А-А-Т-С-T-С-А-G-А-А

А-А-G-А-Т-С-Т-Т-Т-А-С-Т

G-А-Т-С-Т-Т-А-А-G-С-А-G

А-А-С-А-А-С-G-А-А-С-Т-Т

G-T-С-G-А-А-С-А-G-G-С-Т

С-А-С-А-А-С-Т-А-А-Т-А-С

С-T-.Ò-С-Т-Т-С-Т-С-С-T-Т

Т-Т-С-G-А-С-А-А-С-Т-Т-С

G-Ò-T-С-Т-С-А-С-С-С-T-С

С-А-Т С-С-Т-А-Т-Т-А

При комнатной температуре

Таблица 2

Соединение

Последовательность

Составитель Н. Кузенкова

Техред А.Кравчук Корректор М. Васильева

Редактор А, Маковская

Заказ 3765/59 Тирам 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уиго).од, ул. Гагарйна, 101

Т, Т, Т, Т

Т, Тs

Т, Tlo

Т, Т„

Т ($ 44 т, Т<6

H)

Н2

НЗ

Н4

Н5

Нб

Н7

Н8

B)

В2

ВЗ

В4

B5

Вб

В7

В8

В9

В10

AATTCATGTT

CGTCAATCAGCA

CCTTTGTGGTTC

TCACCTCGTTGA

TTGACGAACATG

CAAAGGTGCTGA

AGGTGAGAACCA

AGCTTCAACG

AGCTTTGTAC

CTTGTTTGCGGGT

GAACGTGGTTTC

ТТСТАСАСТССТ

ААСАСТСССС

AACAAGGTACAA

ACGTTCACCGCA

GTAGAAGAAACC

АСТСТТАССАСТ

GATCCGGCG

)2 20 ° 3

13 22.0

)5 24.8

)2 20.)

)3 22.6

12 20.2

12 20.4

I2 2).1

)2 20.5

l2 20.4

12 )9.9

12 20.5

)2 20.2

10 17.2