Штамм бактерий рsеudомоnаs sp., используемый в качестве тест-культуры для определения никотиновой кислоты
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, являющегося тест-культурой для определения никотиновой кислоты. Целью изобретения является новый штамм бактерий PSEUDOMONAS SP. ВКПМ В-3834, специфичный и чувствительный к содержанию никотиновой кислоты в среде, с помощью которого можно выявлять продукцию никотиновой кислоты, начиная с 0,1 мкг/мл, на простых по составу жидких и агаризованных минеральных средах у различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирующих низшие спирты /этанол и метанол/ в качестве источника углерода и энергии. Минимальная концентрация никотиновой кислоты, обеспечивающая рост бактерий этого штамма в жидких и агаризованных минеральных средах, составляет 0,1 мкг/мл. На агаризованных средах можно проводить только качественное определение продукции никотиновой кислоты, на жидких - качественное и количественное. В жидких средах прямо пропорциональная зависимость роста штамма от количества никотиновой кислоты в среде наблюдается в диапазоне концентраций последней 0,1 - 1,0 мкг/мл. 1 ил., 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
А1
ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТН1<)ИТИЯМ
ПРИ ГННТ СССР
ОПИСАНИЕ HSQF
Н А В" JPCHGMX, СРИДЕ ГЕЛЬ (2l } 4.4 .. )00/3 ) -i ( (2! 14. 12.b" (46) 15. 01. пО, 1)юл.",2 (71) . 1елог)усе,irll го . .;f. рс гвечнс(й, циверсцте и, !<,11. !е.(ина
E? ) EI, If, Мак, . Вс), И. 11, ОЛЕХНОВИЧ и EO„E;. )ом11 ) (53) бб3. 1 ),(!II Я) (5б) Ме ..1дь<:.,1) < l бактерио ...1 ии. СбсрНИ1;. fi. l ; . 3 т. 1, С.. 260-268. ,1)л,г»а, ()с с.»с ) )) opñ;. 1975, )), 1, f) 1 (5 Ф ) |) 1 1 ;<1(1 1 rir! Р- 1 11()011<01)Лс (;Р
EI<"l; . " ЕIIEEII 1) !(, :) с1,"(,TE I4I ГЦ ", .: .:. I(<.: Ь)< ): -«) сРЕтЕНИЯ ЯВ-с ".я ь з)
I а с p,, EР .- .,4 11енифичпый и <1зобр(. T< "ff(<>THocfrTc Р) . )1, Il I .. f р. г. l!I. f звляется новый <ята "...- . Р) и Рso -<ем<1) < .::; ., мо «но выявлять продук< (Ill ) I I < 1. < ) I, I ) I) ) в <)Ir кислоты начиная О, 1 1 с; ..-),,1: ГГ тЫХ IIO СОСтаВУ „„SU„, I 535893 (51) 5 С 12 N 15/00, 1/20,, С 12 Q 1/00//(С 12 И 1/20, С 12 )) ) ° с< 2 чувствительный к содержанию нцкотицовой кислоты в среде, с помощью которого можно выявлять продукцию никотиновои кислоты, цачцная с 0,1 мкг/мл, на простых по cocTаву жидких ц агаризованцых минеральных средах у различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирующцх низшие спирты (этанол lr метанол) в качестве источника углерода ц энергии. Минимальная конце1<трацця никотинс вой f(HcrloThr обеспечивающая рост бактерий этого штамма в жидких и агарцзованных минеральных средах, составляет 0,1 мкг/мл. Ца агаризованных средах можцо проводить только качественное определение продукц1ги никотиновой f,rrcvo Tf.f, на жидких — качественное ц количественное. Р жидких средах прям<) пропорциональ ая зависим<эсть рос T,I штамма OT количеств никотиновой кислоты в ср де наблюдается в днап;<.I<»re "oнцентраций последней 0,1 — 1,0 мкr /frë. 1 ил. жидких и агаризованных минеральных средах у различных гр1пп микроорганизмов, в том числе ассимилирующих низшие спирты (этанол и метанол) в качестве источника углерода и эцергци. Штамм получен с пс мощью нцтрозогуаццдина и является ауксотрофным по никотцновои кислоте мутант<м штамма дикого типа Рзе(fdomofrfr s яр. М, выделенного иэ сточных вод Минск< г завода медпрепаратов. Идецтификаццю мутации пас1 у бактерии Рвем(1ошопав зр. М осуществляли по 1535893 отсутствию способности расти на минеральных средах без никотиновой кислоты. Минимальная концентрация никотиновой кислоты, обеспечивающая, рост бактерий этого штамма в жидких и агаризованных минеральных средах, составляет 0,1 мкг/мл. Штамм Pseudomonas sp. (лабораторный номер М11)хранят в лиафилизирован-,0 ном состоянии, Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промьппленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-3834 и имеет следующую характеристику. 15 Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы с округлыми концами О,бх2-3 мкм, подвижные с 2-4 манопалярными жгутиками, граммотрицательные, спор не образуют. Колонии на агаризованных питательных средах (мясопептаннам агаре, Кинг В агаре) гладкие, плоские, круглые, серовато-белые с ровными краями. Через 24 ч при 28 С образуют колонии 23 мм диаметром. Рост па уколу в МПА . умеренный, в основном на поверхности среды. В жидких питательных средах )бразчет интенсивн
Х<>ра<пс раста- )га м«нера.;» <;,:с <с простor о состава,;>nlro1II< >II l- х ll, >«)!. новой кислотой. Физиолого-биохи <ические и; «зч к». Отн.>ш ние к источникам угл;-од1, 35 используют глюкаэу, гз)иц<1!))<н а хар:— зу, галактозу, мальтозу, фрук.. аз<>, этанол, метанол, тирозин, фенила )а)>)п), орнитин, г))ицин, лейцин, глютаминовую кислоту аспарагинавую кислоту. Не 40 утилизирует: арабинозу, .<аннозу, ксилозу, лактозу, маннит, раффинозу, дульцит, сорбит, целлабиозу, инозит, серии, лизин, трилтофан, антраниловую кислоту, ацетамид. Отношение к источникам азота: использует амманийный,нитратиый! азот, мочевину. Реакция на оксидазу и каталазу положительная. Реакция Фогес — Проскауэ50 ра отрицательная. Индол не образует. Тест на анаэробную аргинин-дегидралазу полаяв<тельный. Реакция на анаэрабную денитрификацию отрицательная. Лецитиназная активность отсутствует. Не гидролизует крахмал, желатин. Твин-80. Образует желто-зеленый водараств >римьп флюоресцирующий пигмент на среде Кинг В. Внутриклеточиа -<7 ll:! мг нт» не образует. Облигатный аэраб. Оптимальная температур» роста 2832 С. Оптимальный рН 6,8-7,3. Штамм Pseudomonas sp ВЕПМ В-3834 может быть использован в каче твс индикаторной тест-культуры для качесt венного и количественного определен)<я п1)одук! ии никотиновой кислоты на <1 1 ризаванных и в жидких < реда .. На агаризованных средах можн< пр. » <водить только качественное определ< вне продукции никотиновой кислО:ы, „ в ><зц!— ких средах — качестве><нос и к< .!"- ественное, Проведен>)ый! ан;. э з;.Висим >с .. ежду величиной зоны ро. га )<н„и .атс рного штамма Р.".Pu<1 )m:>,1). 81Я!1 ";-38 на агаризованна -,Вле . )Ä » ° l> т !.,ш! количествам нико синов и к<галеты и<>з— волил установить, . т I<е.ч<чи«а зо>п„ иидик; торной культуры в:врастает прямо прс пс рциональна:,oëè cтв никотиновой кислоты только в очень у)! ом диапазоне кан.,« . I)àöllè, а ик<<зн))о от 0,1 да О,> мк л. Гезульт) ., «л oв с !p ующи<): Ка Ill .<зс i а . ll <)T.I- Диане ):) зоны, "l II.lr Лоты, см <.-! M;I 0 О 0,05 0 0,10 1,3 0,15 ?,U 0,20 2,9 0,25 3,7 0,30 0,35 4,5 0,40 4 7 0,45 0,50 Никотиновая кислота в кс)личеств<. 0,3 мкг дает максимальный размер зонь; роста индикаторного штам)<а на агариз<)ванной среде (4,5 см). Д1льне,<шее увеличение количества никотинов<"! кислоты уже не приводит к возраст.)ни>в ра з)<еров зоны. В дипазоне 0,1-0,3 мкг/м l никотиновой кислоты можно проследит!. прямо пропорциональную зависимость увез)и»ения размеров зоны рост» индикаторной тест-культуры ат количества никотиновой кислоты. Однако даже в .)там llllsll1.)< ие размеры зоны роста ин)в<като!>Лай т<..т-куль153589 l тури нл лглри.».>r»линой сре>(е мо! Ут вар(ировлть i» .»лви< имости От и roT1toc— ти и марки а! лрл и других факторов. Поэтому 21JIH llэу>3ен!(я продукции никоти5 новой кислоты пл плотных средах реко— мендовлно исп<).!ьзовлть шглмм только для качественного анализа, причем IIpoп > !.» l );!<>;.; : l j» ); c !> (> l: д(» » :,>>t>rto рег ис; >н! (!>:>. I:. I-, л:(Кг/гм (. 10 !!pl(к"..II(!)и!(е!(тл" . Ом лн,>..иэе злвиси!Ко("(>f р;< btep<)â ><,Hhl роста ((ндикато;)I > OC> I>(Т;>. ((.л «>Т (()2)ич=с THH I(if!CO ТИН<>1)ОI! 1;t ".!«:ТЫ ПI>ll И(!IO!Ibýîâ 31(ни ЛГЛ pff »О. л IHEIH сред, с:>".;>bill>c н каче< Tr»e (5, > тG÷:(:IH.>, .Jlt pc !л l> .>не(). Ии )т;(!(ол или (! <> 1 :2 1 г О, (, > : .? > H > Н г ), < t l !1 t «7 П Лг 3 О Н В кот<>< < (": ».!IH .(л . Tt >< г и,!)ни(опал ь!ля злв!ic;...., p. <и(p,! < . и от количества никоти!Iol. ol! к;.с. )Tм, т. «(1>o такой же, 20 КЛК 1> На; !)E, ) . -: 1>г 1« >, И )IЛХОДИТ ся в ripe,", (лх (> -(, . ((. " .(л г эазмеры 3С и I7:,. Т. 11; Е(! !1! (II, . (, J. CО ПРИ ИСпользовании <;>с;(с 1;OT Hi(()J.см з ны роста индш<.(торп> (") ггглммл н б Од)(мс ре-25 гистрироплт; и; cутки поз,:е. В >GIIl re! t.; !> ел 7 х с п<>мо:I(I.!(> птамма Bl(lIM Б-3834 .(o>I Г <," С, » С !1! . O С $»! C Г Л.:IHI() I. УТЕ !1 У4 0) г; I> F« -; >C ° «((1!!ЕРаЛЬ— нс . e . Ir <, .сс ».(>; (, t ее пробы, (<.." le! > 1 1 1 1(» 7 .(ОГУ. Коли- 35 . с . (3O н«к:I t,i» l с!3:;1<; Г:. I< и; збе, < e;>,,и., (*с. » H:!» IIol за lllilii апти ЧЕ,;О>,; -;«, 7 П ((l>! ) КУJ(bТУРЬ С 2Ï l>c !,О 1> н,< и!(е)(. < >и(>! (. >(О! О ГГл>!>Ика, !!з ((1>т ;>хе lf 1,0 М(, » . > l:)!! К(ЭН(г«эl Тpe!.;И>И HHKOTH 50 >: », !« t(> ь(, 0 мкг/IJT величина ОП54(3 дос;"„> <г - <лi:: -!.b(7HI I!Gão значения и гри да,!>I. й>ае!! увел((пени . концентраI>J!tt 1! (к -.и! !<ой к;(слоты изменений Ог(зи !О<.к и, от!(«. (л(ку !ьтуры уже не нл б:!(e,;, . . < > ° бр((ее ныг оком содер;>лпии ill <: >;:!, »< ". К.(слоты количестВС<НИИИ "t >ЗИ ПР:И .:;). IHT "ОПЬКО ПРИ С Л> Г: (2 г. !)> e! I;: !(C>IIÈI3 ПрОбЫ. 1;1 к и м О 61);l 3 О м с 1! с 11 Ол ь 3 О в а н l f е м штлм)(л ВЕГ1Г1 В-3834 в жидкой среде Mo>t 1,0 мкг/мл. г! р .«:«.. !) i (.,(1>e((IГ life нико.. > I, > !3 C H (К l! C ((, I 1(Ë;1 . р f . 3 O r3;1 и > I f . с p C Пег!ают посев штам"(л с косяка 13 Г!!!Б либо другую питательную среду, обеспечиваюцую рост бактерий, и куль— г>(!»иг уют в течение ночи (rplf 28 С. Вате(: бактерии Отмь!влют д(»лжды физиологическим рас Tt»<2po t с помощью центри<<>угиро(»лния (10 мии, 5000 g) и ресуспендируют до первоначального объема в это((же растворе, 0,1 мл суспензии клеток вносят в пробирку с 4 мл расплавленного и охллжденного до 45 С и!1!и(!(лльп< "о полужпдкого лгара (О, 7%), г(ри(Отов-(erfrtoro I(a ocf!Grfe минеральной среди Г(9 следуюцего состава, 7.: глюк<2(»а 0,2; Г1а нР04 (безводный) 0,6; К!1,Р0+ 0,3; NaC1 0,05; NH+Cl О,1; СлС1 0,0015; HgS04 7Н 0 0,2; рН 7,0. Засеянную среду наслаивают вторым слое)(на поверхность агаризованной среди (1,5%) того же состава. После застилав((я верхнего слоя с культурой индикзторного штлммл уколом деллют г! .-е и отд льних клонов испытуемых (а !родукцию IIHKoTIfi!оной кислоты К г г!>,ТУР («(ИКРО<7Р ГЛ Низ !.(ОВ УТИГ!И) ИР > К)i!(If v 13 каче с тве источник» углерода и энергии глюкозу. Пробы выращивают в течение 24-48 ч нри 28 С. Вокруг колоний, клетки котор!.(х г!родуциру()т никотино(»ую кислоту, наблюдаются четкие зоны ростл индиклториого штамма. В!(!ГГ! В-3834. l! p e p 2. Посевной материал тест-культуры и пос.педующие процедуры проводят аналогично примеру 1, однако в качестве источника углерода и энергии i3 используе!(.(е минеральные среды добавляют вместо глюкозы 17 этанола. Уколом деллют посевы культур микроорганизмов, утилизирующих этанол, определяя по росту вокруг укола штам((а ВКПГГ,В-3834 образование никотиновой кислоты. Г! р и м е р 3. Посевной материал штамма и последующие процедуры проводят как в примере 1, однако в качестве источника уг;!еродл и энергии В ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ !ГИНЕРЛ>(! !(Ь(Е СРЕДЫ ДОбавляют 1% метлн<лл и .(еллют посевы 1535893 Формупа из о бр втяни ОП ЬМ 12 g5 pg рц gp g,3 !0 ниномиио8ая юислор а, мгМ/ /4Я Составитель Л. Минеева Редактор Т. Лаэоренко Техред N.Äèäûê Корректор С. Цекм, и Заказ 85, Тираж 491 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям ири II.II I <.i »! 1131I15, Москва, Ж-35, Раушская наб.,,>. 4/5 Производственно-изцательский комбинат "Патент", г.ужгород, у: . 1 я, I.««,,1»1 испытуемых на продукцию никотиновой кислоты культур микроорганизмов, утилиэирующих метанол. Пробы выращивают в течение 48-72 ч. II p H M e p 4 Определение продукции никотиновой кислоты в жидких средах. Посевной материал штамма ВКПИ В-3834 готовят как в примере 1. Затем 0,1 мл посевного материала вносят 10 в пробирку с 4 мл жидкой минеральной среды М9, содержащей в качестве источника углерода 0,27. глюкозы и 1 мл пробы (культуральной жидкости испытуемдго штамма-продуцента, полученной после культивирования в жидкой среде .и последующего осаждения клеток с помощью центрифугирования при 5000 g в течение, 10 мин). Пробы выращивают в течение 24-48 ч при 28 С. Наличие ни- 2 котиновой кислоты в пробе, а также ее концентрацию определяют, и > я". из показаний оптической плоти,:с -u (ОП 540 культуры и калибровочного графика. Полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Pseudomonas sp. ВКПИ В вЂ 38 можно выявлять и изучать продукцию никотиновой кислоты, начиная с 0,1 мкг/мп, на простых по составу минеральных средах среди. различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирующи:: низ;I e спирты (зтанол и метан я) в качест . источников углерода и .»« ргии. Бтамм бактерий Pseu 1 i.. з; яр,. !1IIIIIl В-3834, использусмыи . s. ° :г .. тс ткуЛьтуры для с>пр ",. i иия иик, тип и..ой кислоты.
