Стимулятор эмбриогенеза в культуре растительной ткани
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методам культивирования растительной ткани и может быть использовано для нужд клеточной и генетической инженерии. Целью изобретения является ускорение эмбриогенеза и увеличение количества эмбриогенных морфогенетических зон в культивируемой ткани. Способ состоит в том, что на культивируемые ткани растений воздействуют парафторфениланином, добавляя его в питательную среду в концентрации 10-100 мг/л, применяя тем самым данное соединение в качестве стимулятора эмбриогенеза. Способ позволяет увеличить выход эмбриогенных морфогенетических зон на культивируемой ткани, а также получать большое количество эмбриондов и регенерантов уже в первом пассаже. 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН (19) (И) 44798 А1 (51) 5 С 12 N 5/00
06 ;нд3 с 11Ц .1С, г
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
flQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
К А BTOPCH0MV СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4409464/31 — 13 (22) 12.04.88 (46) 23.02.90. Бюл. 11 - 7 (71) Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР (72) О.В,Захленюк, И.А.Костенюк, В.А.Кунах, С.А.Рабинович и И.Н.Кузовкина (53) 631.522:58.083.5(088.8) (56) Сидоров В,А., Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматическая гибридизация пасленовых. — Киев:
Наукова думка, 1985, с. 132 ° (54) СТИМУЛЯТОР ЭМБРИОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ РАСТИТЕЛЬНОИ ТКАНИ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методам культиИзобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению эмбриоидов и регенерантов в культуре растительной ткани.
Объектами исследования служили культуры тканей табака (Nicotiana
tabacum) и мака прицветникового (Papaver Ъгассеагum Lindl) °
Культура тканей табака широко используется как модельный объект в различных направлениях селекционногенетической работы in vitro а также как продуцент ряда ценных веществ, в частности убихинона. Культура тканей мака прицветникового представляет собой перспективный источник морфиновых алкалоидов. В последнее время все большее внимание уделяется разработке способов выращивания культур
2 вирования растительной ткани и может быть использовано для нужд клеточной и генетической инженерии. Целью изобретения является ускорение эмбриогенеза и увеличение количества эмбриогенньж морфогенетических зон в культивируемой ткани. Способ состоит в том, что на культивируемые ткани растений воздействуют парафторфенилаланином, добавляя его в питательную среду в концентрации 10-100 мг/л, применяя тем самым данное соединение в качестве стимулятора эмбриогенеза. Способ позволяет увеличить выход эмбриогенных морфогенетических зон на культивируемой ткани, а также получать боль- I шое количество эмбриоидов и регенерантов уже в первом пассаже. 2 табл. тканей — продуцентов ценных вторичных метаболитов, сохраняющих способность к морфогенезу. Так, в существующих ныне штаммах мака прицветникового спектр синтезируемых алкалоидов изменен в сторону бензофенантридиновых алкалоидов, а морфиновые, в частности тебаин, появляются лишь в эмбриоидах и регенерантах. Поэтому надежный и эффективный способ получения регенерантов важен для обоих видов.
Цель изобретения — ускорение эмбриогенеза и увеличение количества эмбриогенных зон в культивируемой ткани.
Способ состоит в том, что на культивируемые ткани растений воздействуют парафторфенилаланином, добавляя его в питательную среду в концент1544798
До 1 л
В среду добавляют дополнительно
60-. 100 мл/л парафторфенилаланина.
В качестве контроля выращивают ткань на питательной среде приведенного состава без добавления парафторфенилвланина. рации 10-100 мг/л. Это соединение является известным. Парафторфенилаланин используется как селективный фактор для поддержания пролиферации гаплоидных клеток в культурах тканей растений. Как стимулятор эмбриогенеза ранее он не применялся. Ткани предварительно выращивают в течение нескольких ростовых циклов на обычной питательной среде с добавлением парафторфенилаланина до их перевода на эмбриогенную среду, либо сразу переводят на эмбриогенную среду, содержащую парафторфенилаланин ° В течение 1-3 ростовых циклов отбирают эмбрибиды и регенеранты, укореняют их и высаживают в грунт или культивируют далее
in vitro.
Пример 1. Культуру тканей табака получают и выращивают на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга, которой присвоен индекс
МС-2. Среду готовят так, чтобы в 1 л ее содержалось, мг: 25
ЯН,NO, 550
""Оз 633,3
СаС1 .2Н20 146,3
М8$0, 7Н,О 123,3
КН РО4. 56,6
"ЗВОЗ 6 2
Мп$04 4Н 0 22, 3
СоС1 6Н О 0,025
Со$04 58>P 0,025
ZnSO4 7Н 20 8,6
Na ÌoO4 2Н О 0,25
KJ 0,83
FeSO4. 7Н20 27,8
Na2EDTA . 2Н О 37,3
Тиамин 0,4
Мезоинозит 80
Са-Пантотенат 5
Гидролизат каэеина 1000
d-Нафтилуксусная кислота 2
Индолилуксусная кислота 0,5
Кинетин 0,1
Сахароза 30000
Агар-агар 8000
Дистиллированная вода
Среду разливают в сахарные пробирки по 6 мл в каждую, автоклавируют
15 мин при 1 атм. После застывания среды ткань табака рассаживают по
0,3-0,4 r на пробирку. Через 30 сут ткань пересаживают на свежую среду.
После культивирования в течение
7 мес. ткань обоих вариантов переводят на эмбриогенную среду Т-3 и выставляют на свет (12-часовой световой день, лампы дневного освещения, освещенность 1800-2000 лк, температура 26 + 1 С).
Среду Т-3 готовят так, чтобы в
1 л ее содержалось, мг:
Кн ИО 550
633,3
СаС12 2Н 20 146,6
NgSO . 7Н20 123,3
КН РО4 56,6
3 3 6,2
Nn SO4 4Н 20 22,3
СоС1г 6Н О 0,025
CuSO4 5Н20 0,025
Zn SO4 . 7Н 0 8,6
Ка2МО04- 2н 20 . 0,25
KJ 0,83
Fe$O4 7Н20 27,8
Na2EDTA 2Н20 37,3
Тиамин 0,4
Мезоиноэит 80
Са-Пантотенат 5
Гидролиэат каэеина 1000
Индолилуксусная кислота 0,2
Кинетин 1,5
Сахароза 50000
Агар-агар 8000
Дистиллированная вода
До 1 л
Результаты анализа трех последовательных ростовых циклов на эмбриогенной среде представлены в табл. 1.
После выращивания тканей на среде, содержащей 100 мг/л парафторфенилаланина, предлагаемый способ превосходит известный по частоте регенерации (отношение субкультур с эмбриоидами к общему числу субкультур) в 1-м, 2-м и 3-м пассажах соответственно в
3 5; 3,3 и 2,7 раза. В среднем за три пассажа предлагаемый способ повышает частоту регенерации более чем в
3 раза по сравнению с контролем. Количество эмбриоидов и регенерантов на отдельную субкультуру опытного варианта намного превышало контрольное.
1544798
При более низких концентрациях (80 и 60 мг/л) парафторфенилаланин подобного эффекта не обнаружил.
Пример 2. Для выращивания культуры тканей мака прицветникового готовят модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга (индекс среды
PW) так, чтобы в 1 л ее содержалось, мг/л:
1
30000
8000
До1л
Среду разливают в пробирки по 5 мл в каждую. Стерилизуют 15 мин при
1 атм. После застывания среды ткань мака рассаживают по 0,3-0,5 г на пробирку и культивируют, пересаживая каж дые 15 сут на свежую среду.
Затем готовят эмбриогенную питательную среду как описано, исключая из ее состава 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и кинетин и добавляя пара
КН4ИОЗ
KNO
СаС1,, Мазо 7Н70
КН РО
Н ЗВоз
Ип50 4Н О
СоС1 6Н О
Cu SOq 5H О
ZnSO< .7НтО
Na МоО„. 2Н тО
KJ
Fe SO q. 7Н О
Na Тиамин Мезоинозит Пиридоксин Никотиновая кислота Гидролиэат казеина Глицин 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота Кинетин Сахароза Анар-агар Дистиллированная вода 1650 1900 440 370 170 6,2 22,3 0,025 0,025 8,6 0,25 0,83 27,8 37,3 0,1 100 0,5 0,5 500 40 фторфенилаланин в концентрации 10 60 мг/л. Ткань мака со средним темпом роста в возрасте 15 сут переносят на эмбриогенную среду и выставляют на свет (12-часовой световой день, лампы дневного освешения, освещенность 1800-2000 лк, температура 26 + 1 С). В качестве контроля выращивают ткань на указанной эмбриогеныой среде беэ добавления парафторфенилаланина. Результаты анализа двух последующих ростовых циклов представлены в табл.2 ° Как видно из приведенных данных, частота регенерации в опыте (при концентрации парафторфенилаланина 10 мг/л) в 1-м и 2-м пассажах была соответственно в 4,6 и 1,5 раза выше, чем в контроле. Предлагаемым способом удалось получить в 1-м пассаже в 4,9 раза больше, а во 2-м — в 2,4 раза больше эмбриоидов в расчете на каждую субкультуру по сравнению с контролем. В среднем за два пассажа культивирования предлагаемый способ позволяет увеличить выход эмбриоидов на каждую субкультуру более чем в 3 раза по сравнению с контролем. При концентрации парафторфенилаланина 30 мг/л незначительный эффект стимуляции регенерации отмечен в первом пассаже. При более высокой концентрации (60 мг/л) парафторфенилаланин подобного эффек-, та не обнаружил. Таким образом, предлагаемый способ гозволяет интенсифицировать процессы регенерации в культуре тканей табака и мака более чем в 3-4 раза. Оптимальными концентрациями парафторфенилаланина в укаэанных способах стимуляции регенерации являются: в культуре тканей табака 100 мг/л, в культуре тканей мака прицветникового 1О мг/л. Формула изобретения Применение парафторфенилаланина в качестве стимулятора эмбриогенеза в культуре растительных тканей. 1544798 Таблица 1 Число субкультур с эмбриоидами в среднем эа три пассажах, Х Пассах Число субкультур с эмбриоидами, Х Вариант 20,0 30,0 30,0 2 26,6 70,0 100,0 80,0 100, 0 83,3 80,0 23,3 60,0 Таблица 2 Пассам Вариант 0,647 1,929 11,8 57,1 Ткань на эмбрио- 0 генной среде .(известный способ) 1,226 10,0 3,960 54,5 85,7 3, 182 4,571 30,0 37,5 18,8 0 531 60,0 * Коэффициент эмбриогенеза рассчитывали как отношение учтенных эмбриоидов к общему числу субкультур данного варианта. Составитель В.Демкин Техред М,Дидык Корректор А.Обручар Редактор Н.Яцола Тирах 487 Подписное Заказ 470 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.умгород, ул. Гагарина, 101 Ткань на эмбриогенной среде Т-3 после семи пассалей на среде MC-2 (известный способ) Ткань на эмбриогенной среде ТЗ после семи пассией на среде МС-2 с добавлением ПФФА Ткань на эмбриогенной среде с добавлением ПФФА Концентрация ПФФА, мг/л Концентрация ПФФА, мг/л 30,0 30,0 10,0 0 Число субкультур с эмбриоидами, Х Коэффициент эмбриогенеза* 0,875 О, 188 Коэффициент эмбриогенеза (средний эа два пассажа) 
