Способ определения удельной активности липаз в реакциях переэтерификации жиров и масел

 

Изобретение относится к масло жировой промышленности и может быть использовано при определении степени переэтерификации жиров и масел. Целью изобретения является повышение точности результатов определения удельной активности липаз в реакциях переэтерификации жиров и масел. Цель достигается в результате использования в качестве внутреннего стандарта синтетического, не встречающегося в природе, триглицерида с нечетным числом атомов углерода, дополнительного отделения части пробы перед алкоголизом, в которой определяют количество гидролизовавшихся в процессе переэтерификации жиров и масел путем проведения реакции с родамином 6Ж в бензольном растворе и спектрофотометрирования по полосе поглощения при 515 нм, определения удельной активности липаз по формуле A=M(1-K-A/M)/Л<SP POS="POST">.</SP>Т, где M - общее количество триглицеридов в смеси, мкМоль, K - доля непрореагировавшего внутреннего стандарта, A - количество гидролизовавшихся триглицеридов, мкМоль, Л - количество липазы, мг, T - время реакции, ч.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

QQ (И) уц i С 11 С 3/!О

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . Н А8ТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHAM

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4397383/30-13 (22) 26.02.88 (46) 23.04.90. Бкл. N - 15 (71) Институт биологии моря Дальневосточного научного центра АН СССР (72) Н.А.Латышев, Н.В ° Гайдай, С;П.Касьянов, А.Ь .Имбс, Х.Т.Хасанов, И.Т.Якубов и М.M.ÐàõèìîB (53) 665.1.1 (088 ° 8) (56) Руководство по методам исследо-. вания, технохимическому контролю и учету производства в масло-жировой промышленности. — ВНИИЖ, 1982, т.6, вып.3, с.274-280. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УДЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗ В РЕАКЦИЯХ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ ЖИРОВ И МАСЕЛ (57) Изобретение относится к масложировой промышленности и может быть использовано при определении степени переэтерификации жиров и масел, Целью изобретения является повышение точности результатов определения удельИзобретение относится к масло-жировой промышленности и может быть использовано при определении степени переэтерификации жиров и масел.

Цель изобретения — повышение точности результатов определения удельной активности липаз в реакциях переэтерификации.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят модельную смесь масла и синтетического, не встречающегося в природе, насыщенного триглицерида

2 ной активности липаз в реакциях переэтерификации жиров и масел. Цель достигается в результате использования в качестве внутреннего стандарта синтетического, не встречающегося в природе, триглицерида с нечетным числом атомов углерода, дополнительного отделения части пробы перед алкоголи" зом, в которой определяют количество гидролизовавшихся в процессе переэтерификации жиров и масел путем проведения реакции с родамином 6Ж в бенэольном растворе и. спектрофотометрирования по полосе поглощения при 515 нм, определения удельной активности липаз по

M(1 - К - -) а M формуле А = — — — — — — —, где М вЂ” обЛ Т щее количество триглицеридов в смеси, мкмоль, К вЂ” доля непрореагировавшего С „ внутреннего стандарта,. а — количество гидролизовавшихся триглицеридов, мкмоль, Л вЂ” количество липазы, мг., Т вЂ” время реакции, ч. (ТГ) с нечетным числом атомов углерора которую растворяют в гексане, и,. р подвергают переэтерификации в.присутствии фермента — липазы. Параллельно с этим ставится контрольный опыт, где присутствуют все компоненты и в тех же количествах, за исключением фермента. Через 24 ч реакцию переэтерификации останавливают добавлением к смеси 0,1 N НС1 в этаноле. Затем к смеси добавляют хроматографический стандарт — этиловый эфир бегеновой кислоты, и экстрагируют

1558872 гексаном. Из экстракта выделяют две пробы,. одна из которых используется для.определения количества гидролизовавшихся триглицеридов, а другая для определения кислотного состава смеси после переэтерификации. Количество гидролизовавшихся триглицери-. дов находят в результате упаривания гексана, .растворения остатка в бензоле, взаимодействия его с родамином, 6Ж и определения оптической плотнос:ти полученного раствора при Я =-515 нм.

Для определения кислотного состава смеси пробу гексанового экстракта наносят на пластину с закрепленным слоем силикагеля КСК, пропитанного нитратом серебра, хроматографируют и выделяют фракции, которые соответствуют насыщенным триглицеридам и насыщенным этиловым эфирам. Затем проводят злкоголиз выделенных триглицеридов и эфиров, повторное их хроматографирование на силикагеле и количественное определение кислотного состава методом газовой хроматографии, откуда находят долю непрореагировавшего внутреннего стандарта.

Удельную активность липазы определяют с учетом гидролизовавшихся в процессе переэтерификации триглицеридов по формуле

М(1 — К - -) а

50 где А — удельная активность липазы, мкмоль/мг белка ч, М вЂ” общее количество триглицерИдов в смеси, мкмоль; 40

К вЂ” доля непрореагировавшего внутреннего стандарта от исходного количества," а — количество гидролизовавшихся триглицеридов, мкмоль, 45

Л вЂ” количество липазы (в расчете на 100%-ный белок), мг;

Т вЂ” время реакции, ч.

Пример. 30 мг оливкового масла смешивают с 6 мг трипентадеканоатглицерина. Объем доводят до 1 мл гексаном и добавляют 2 мг препарата панкреатической липазы. В препарате

90% белка, т.е. чистого белка добавляют 1,8 мг. Процесс проводят,при постоянном перемешивании при 37 С в течение 24 ч. Параллельно с этим ставится контрольный опыт, где присутствуют все компоненты и в тех же коли240

3,0

0,9 где h высота пика внутреннего стандарта (грнпентадеканоатчествах sa исключением фермента. После 24 ч реакцию останавливают добавлением 1 мп 0,1 N HCl в этаноле (ингибируют фермент). Затем к смеси добавляют 6 мг хроматографического стандарта — этилового эфира бегеновой кислоты. Смесь экстрагируют 4 мл гексана. Затем 0,5 мл гексанового слоя наносят на пластинку 6 6 см с закрепленным слоем силикагеля КСК с размером частиц 3-7 мкм. Пластинку перед использованием пропитывают нитратом серебра погружением в его насыщенный раствор в этаноле при 18 С.

Хроматографию проводят в чистом о хлороформе при -12 С. Далее пластинки опрыскивают 0,01%-ным раствором родамина 6Ж в 96%. -ном этаноле и, проявляя

4од УФ-лампой, собирают две полосы с 1=0,7 и 0,9, что соответствует насьпценным ТГ и насьш1еннЫм этиловым эфирам. С силикагеля. липиды элюируют

2 мл хлороформа, упаривают и растворяют в 1 мл бензола, добавляют 0 5 мл

1%-ного раствора натрия в этаноле и выдерживают на водяной бане 15 мин при 50 С, после чего добавляют 1,5 мл

5%-ного хлористого водорода в этаноле и выдерживают,при той же температуре 30 мин. Смесь упаривают до объе-. ма 0,5 мл, наносят на пластинку и хроматографируют в бензоле, пятно эфиров (1=0,7) элюируют 3 мл .хлороформа. Далее проводится анализ эфиров на газовом хроматографе при условиях:

Температура

KOJIOHKH С 210

Температура испарителя, С

Температура детектора, С 220

Расход газа-носителя, дм /ч

Расход водорода, дм /ч 2,4

Расход воздуха, дм /ч 24

Шкала самописца, мВ

Объем вводимой пробы, мкл 1,0

Рассчитывают долю непрореагировавшего внутреннего стандарта:

5- 1558872 глицерин, выделенный с фракцией насыщенных ТГ и насыщенных этиловых эфиров при хроматографии на сорбенте .с нитратом серебра, гидролизован до жирных кислот, которые перевели в эфиры — этиловые эфиры пентадекановой кислоты), мм, высота пика хроматографического стандарта (этиловый эфир бегеновой кислоты), мм; отношение высот пиков стандартов до начала реакции (контроль), ед, высота пика внутреннего стандарта после реакции, мм, высота пика хроматографического стандарта после реакции, мм, отношение высот пика стандартов после реакции, ед,, доля непрореагировавшегб внутреннего стандарта (трипентадеканоатглицерина) от исходного количества, Удельная активность липазы В реакции переэтерификации определяется по формуле а — -) М мкмоль

1 ° мг белка ч

M»(1 — К

А

Л Т

Иол.м. смеси находят как сумму всех мол.м. ТГ, умноженных на их долю в смеси: где С,С,С - доли молекулярных типов ТГ в смеси, Р, Р,P — мол.м. ТГ, г.

Доля трипентадеканоатглицерина в смеси составляет 0,167 (6/(30+6), до ля оливкового масла 0,833.

Иол.м. трипентадеканоатглицерина

764 г. Иол.м. оливкового масла (триолеатглицерин) 884 г. Для определения моль ТГ в смеси делят количество ТГ смеси (36 мг на мбл.м. смеси, получают 41,67 мкмоль.

Далее по соотношению пиков на хроматограмме рассчитывают долю не прореагировавшего трипентадеканоатглицерина в смеси после реакции:

Кю

И»К+

+М

К = - = - --- = 0,289.

К h .Н, Ь| Нг

Число молей гидролизовавшихся ТГ в смеси находят по содержанию в смеси жирных кислот с помощью метода спектрофотометрии. Для этого после экстракции переэтерифицируемой смеси гексаном 0,1 мл гексанового слоя упа40 ривают, разбавляют 1,5 мл бензола и добавляют 1,5 мл цветного реагента.

Смесь выдерживают 30 мнн, после чего измеряют оптическую плотность при

515 нм, При этом в кювету сравнения вводят раствор 1,5 мл бензолаи 1,5 мл цветного реагента.

Цветной реагент готовится следующим способом: 20 мг родамина 6Ж растворяют в 20 мл 0,2 И калий-,фосфатного буфера с рН 11. Затем смешивают с 200 мл бензола, после чего бензольная часть отделяется, хранится в сосуде над щелочью (исходный реактив).

При определении используют спектро55

По калибровочному графику, который .представляет собой зависимость опти1 ческой плотности от концентрации жир ной кислоты в кювете, на основании1

M a

М М остаток трипентадеканоатглицерина в смеси после реакции переэтерификации с учетом реакции гидролиэа, мкмоль количество трипентадеканоатглицерина в смеси до реакции, мкмоль, количество трипентадеканоатглицерина, подвергнувшегося гидролизу, мкмоль.

Степень перезтерификации жировой смеси определяется по формуле

Р— =1-К--

M M где P — степень переэтерификации жировой смеси.

Очевидно, что дробь где а — количество всех гидролизовавшихся ТГ переэтерифицированной смеси, мкмоль;

М вЂ” общее количество ТГ смеси, мкмоль

М = С Р +С P +СзР +..., 1558872

Формула изобретения

Г = 8,1 мкмоль.

Количество панкреатической липазы (в пересчете на чистый белок) 1,8 мг.

Используют панкреатическую липазу.

Время реакции 24 ч. Рассчитывают удельную активность данного препарата панкреатической липазы в реакции переэтерификации; мкмоль . А = 0 50 - — - — — ч, мг белка

М(1 — К вЂ” -) а

А = — — — — ——

Л Т

35 общее количество триглицеридов в смеси, мкмоль; доля непрореагировавшего внутреннего стандарта, количество гидролизовавшихся триглицеридов, мкмоль; где MК40

Л вЂ” количество липазы, мг

Т вЂ” время реакции, ч.

Составитель Ю.Скорбов

Техред М,Ходанич . Корректор О.Ципле

Редактор Н.Яцола

Подписное

Заказ 814

Тираж 360

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР.

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Yæãoðîä, ул. Гагарина,101 полученных спектрофотометрических данных определяют количество мкмолей жирных кислот в анализируемой кювете.

Калибровочный график строят, используя стандартные растворы жирных кислот, в данном примере оптическая плотность D=1,295 ед.

По графику находят количество жирных кислот (Г) в кювете (P =, =0,162 мкмоль), образовавшихся в результате гидролиза:

За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух определений. Относительное расхождение между параллельными определениями превышает 5Х.

Таким образом, способ определения удельной активности липаз в реакциях . переэтерификации повышает точность и воспроизводимость результатов определения более чем в два раза (s известном способе погрешнбсть анализа составляет 13%) за счет того, что . исключается перекрывание хроматографических пиков внутреннего стандарта и триглицеридов пробы жиров и масел, а также за счет того, что при определении удельной активности липаз учи,тываются гидролизовавшнеся,в процессе переэтерификации триглицериды.

Способ определения удельной актив5 ности липаз в реакциях переэтерификации жиров и масел, включающий введение в пробу жиров и масел внутреннего стандарта, проведение переэтерификацни, алкоголиз продуктов переэтерификации, выделение фракции насьпценных триглицеридов методом тонкослойной хроматографии, определение жирнокислотного состава этой фракции методом газожидкостной хроматографии и расчет удельной активности липазы по изменению концентрации внутреннего стандарта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности результатов определения, в качестве внутреннего стандарта используют синтетический, не встречакнцийся в природе, триглицерид с нечетным числом атомов углерода, перед алкоголизом дополнительно отделяют часть

25 пробы, в.которой определяют количество гидролизовавшихся в процессе переэтерификации жиров и масел путем проведения реакции с родамином 6Ж в бен.зольном растворе и спектрофотометрирования по полосе поглощения при

515 нм, а определение удельной активности липаз осуществляют по формуле