Способ определения изопероксидаз-антигенов

 

Изобретение относится к физико-химической биологии, а именно к биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, и может быть использовано при изучении пероксидаз, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека. Целью изобретения является упрощение способа определения изопероксидаз-антигенов. Изобретение состоит в том, что при определении изопероксидаз-антигенов перед переносом разделенного белка с геля на нитроцеллюлозную мембрану ее предварительно обрабатывают специфической антисывороткой к антигену, а регистрацию антигена, перенесенного на мембрану, осуществляют, определяя пероксидазную активность.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„SU 1569711 (S1)5 G О1 М 33/535

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4379645/28-14 (22) 17,02,88 (46) О?,06,90, Бюл, М 21 (71) Казахский научно-исследовательский институт земледелия им. В.P.Âèëüямса (72) И.М,Савич (53) 612,015(088,8) (56) Leisola М,S,А. et al, — J,Biol, Chem., 1987, v. 262, р. 41 9-425, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОПЕРОКСИДАЗАНТИГЕНОВ (57) Изобретение относится к фиэикохимической биологии, а именно к биохимии, молекулярной биологии и биотехИзобретение относится к физико-хи- мической биологии,,а именно к биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, и может быть использовано при изучении пероксидаз, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека.

Целью изобретения является упрощение способа эа счет исключения стадии радиоиммунологического анализа, Цель достигается тем, что для выявления изопероксидаз-антигенов на полиакриламидный гель (можно использовать и агарозный) накладывается и прижимается нитроцеллюлозная мембрана, на которой предварительно сорбированы антитела, После определенного вревремени их разделяют и обрабатывают (и гель, и мембрану) реактивами на пероксидаэную активность, На геле пронологии, и может быть использовано при изучении пероксидаэ, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека, Целью изобретения является упрощение способа определения изопероксидаэ-антигенов. Изобретение состоит в том, что при определении иэопероксндаэ-антигенов перед переносом разделенного белка с геля на нитроцеллюлозную мембрану ее предварительно обрабатывают специфической антисыворот-» кой к антигену, а регистрацию антигена> перенесенного на мембрану, o1.уществляют по перокс»щаэной активносявляются все имеющиеся изоформы пероксидазы, а на нитроцеллюлоэной мем-. бране — лишь те, которые являются ан- lwaeL тигенами и свяэывалист антителами, Яд сорбированными на питроцеллюлоэной ЯЪ мембране, ЯР

Способ осуществляется следующим 3 образом, Вжзй

Листья семидневных пророс TKQB кукурузы измельчают в трис-глициновом буфере рН 8,3, содержащем 30% сахарозы в соотношении растительный материал: буфер 1:5. После цс:"трифугирования надосадочную жидкость диапиэуют против дистиллированной воды и осаждают белки ацетоном Полученный щ,Д осадок белков растворяют в 30/ — ном растворе сахароэы и используют для изоэлектрофокусирования „11.»оэлектрофокусирование (ИЭф) проводят в 5%ном полиакриламиц ror» г ;е, содержа1569711

Формула и э обретения

Составитель A.Ñêóðàò

Редактор И, Булла Техред М, Дидык Корректор Л,Бескид

Заказ 1444 Тираж 509 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,iÎi щем 2% амфолинов с интервалом рН 3,510,0. Размер пластины геля 110 х х1 00х1 мм, Режим ИЭФ 15 мин — 130 В;

30 мин — 200 В1 60 мин — 750 В, После окончания ИЭФ на пластину

5 геля накладывают нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,22 мкм с сорбированными антителами (мембрану предварительно инкубируют с антисывороткой при комнатной температуре при постоянном покачивании в течение одного ча"..: ),. " :: .":.у мембраны накладывают 4-5 листов фильтровальной бумаги, пропитанной 0,01 М Иа-фосфатным буфером рИ 7,2 содержащим 0,85%-ную NaC1 накрывают стеклом и прижимают грузом массой 500 г.

Процесс конъюгации антигенов с антителами иде один час при комнатной 20 темперагуре, Затем гель и нитроцеллю., лаэную мембрану разъединяют, гель и мембрану опускают в 0,02%-ный раствор солянокислого бензидина и выдерживают

30 и 5 мин соответственно, после че- 25 го гель и мембрану заливают раствором, перекиси водорода. После того, как появятс ." полосы белков„ обладающих пероксидазной активностью, сравнивают местонахождение их на нитроцеллюлоэной мембране и полиакриламидном геле и идентифицируют изопероксидазантигены, Таким образом, упрощение предлагаемого способа достигается за счет сокращения количества операций кроме того, для его реализации не требуются меченые вторые антитела или белок А, Способ определения иэопероксидаэантигенов, включающий электрофорети" ческое. разделение изопероксидаэ в геле, перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану, определение пероксидаэной активности в геле и регистрацию антигенов с помощью антител на мембране отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет исключения стадии радиоиммунологичес" кого анализа, перед переносом белка нитроцеллюлозную мембрану предварительно обрабатывают специфической антисывороткой к антигену, а регистрацию антигена,. перенесенного на мембрану,,осуществляют по пероксидаэной активности.