Способ получения кормового l-лизина

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения кормового L-лизина биосинтезом из крахмалсодержащего сырья. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Крахмалсодержащее сырье разваривают и гидролизуют действием культур микроорганизмов - продуктов гидролитических ферментов (Ф), взятых отдельно или в смеси, например BACILLUS SUBTILIS-82, ASPERGILLUS AWAMORI ВУД и др. Культуры - продуценты Ф - используют в физиологически активном состоянии - в конце экспоненциальной или начале стационарной фаз. Гидролиз крахмалсодержащего сырья ведут до содержания усвояемых углеводов в среде 3-7%. Температура гидролиза 55-65°С. При этом наряду с гидролизом сырья происходит частичное разрушение клеток продуцентов Ф и выделение в среду продуктов их метаболизма. Затем температуру среды снижают до значения, оптимального для биосинтеза лизина, добавляют минеральные соли и фактор роста, засевают среду культурой - продуцентом L-лизина, ведут одновременно оба процесса: биосинтез L-лизина и ферментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья путем совместного культивирования продуцента лизина и гидролитических ферментов. В качестве продуцентов лизина используют штаммы BREVIBACTERIUM 22 L или BREVIBACTERIUM Е531. Для улучшения аэродинамических свойств среды для биосинтеза лизина в нее добавляют 2-4% мелассы. 3 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

/ (191 (И1 (51)5 С 12 P 13/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

fl0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21 ) 4409790/30-1 3 1 (22) 13.04,88 (46) 07.07.90. Бюл. ¹ 25 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии и Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Л.В.Римарева, M.Á.Îâåð÷åíêo, Т,Б.Милюкова, Б.А.Устинников, A.Ñ,ÒHõîìèðoâà, З.М.Зайцева и С,P.Íåéøòàäò-Абрамович (53) 663.15(088.8) (56) Патент Великобритании

¹- 1200357, кл. С 12 Р 13/08, 1970, Автбрское свидетельство СССР № 386006, кл. С 12 Р 13/08, 1973. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОГО

L-ЛИЗИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения кормового L-лизина биосинтезом из крахмалсодержащего сырья. Цель изоб" ретения — повышение выхода целевого продукта, Крахмалсодержащее сырье разваривают и гидролизуют действием культур микроорганизмов — продуктов гидролитических ферментов (Ф), взяИзобретение относится к биотехнологии и касается способа получения кор- мового L-лизина биосинтезом иэ крахмалсодержащего сырья.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

2 тых отдельно или в смеси, например

Bacillus, subtilis-82, AspergiIlus

awamori ВУД и др. Культурь1 — продуценты Ф - используют в физиологически активном состоянии — в конце экспоненциальной или начале стационарной фаз, Гидролиз крахмалсодержащего сырья ведут до содержания усвояемых углеводов в среде 3-?X. Температура о гидролиза 55-65 С. При этом наряду с гидролизом сырья происходит частичное разрушение клеток продуцентов Ф и выделение в среду продуктов их метаболизма. Затем температуру сРеды снижают до значения, оптимального для биосинтеэа лизина, добавляют минеральные соли и фактор роста, засе- Е вают среду культурой — продуцентом

1.-лизина, ведут одновременно оба про- %Ф У цесса: биосинтез L-лизина и ферментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья путем совместного культивирования продуцента лизина и гидролитических ферментов. В качестве продуцентов лизина используют штаммы Вгеч bacterium 22 L или Brevibacterium 3

Е-53 1. Для улучшения аэродинамичес- Ж ких свойств среды для биосинтеза ли- СД зина в нее добавляют 2-4Х мелассы. (В

3 з,п ф лы Cb

Способ осуществляют следующим образом, Крахмалсодержащее сырье (некондиционное пшеничное, ржаное, овсяное, кукурузное, зерно-картофельное сырье) разваривают и подвергают ферментатив1576566 ному гидролизу действием культуры или

t смеси культур — продуцентов гидролитических ферментов, находящихся в физиологически активном состоянии в конце экспоненциальной или начале стационарной фаз. Гидролиз ведут до содержания в среде усвояемых углеводов 37Х. Температуру поддерживают в пре- " делах 55-65 С продолжительность гидЭ

0 ролиза 1-2 ч. В этих условиях, наряду с гидролизом крахмалсодержащего сырья, происходит частичное разрушение клеток культур - продуцентов ферментов и выделение в среду продуктов их метабо15 лизма. Это обогащает среду биологически активными веществами, при этом гидролитические ферменты сохраняют свою активность. Затем полученную среO ду охлаждают до 29-30 С, оптимальной для биосинтеза L-лизина, вводят в нее го минеральные соли и фактор роста и засевают продуцентом L-лизина. В качестве продуцента лизина используют штаммы Brevibacterium 22 L или Brevibacterium E-531. Биосинтез L-лизина ве25 дут в оптимальных условиях. Одновременно с биосинтезом лизина происходит ферментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья, поскольку в среде содержатся хотя и в ослабленном виде продуценты гидролитических ферментов, т.е. имеет место, совместное культивирование культур — продуцентов ферментов и культуры — продуцента лизина.

Ослабленные культуры — продуценты 35 ферментов не угнетают жизнедеятельность продуцента лизина.

Используют продуценты гидролитических ферментов широкого спектра действия, что позволяет более полно и эф- 40 фективноиспользовать все составные части сырья. Под действием амилаз осуществляется гидролиэ крахмала; под действием протеаз гидролизуются растительные белки, содержащиеся в сырье,45 и происходит обогащение среды легкоусвояемым аминным азотом; под действием целлюлаз гидролизуются некрахмальные полисахариды, образуя усвояемые углеводы. Совместное применение продуцентов указанных ферментов способствует увеличению выхода L-лизина.

Для улучшения аэродинамических свойств среды для биосинтеза лизина к ней добавляют 2-4% мелассы.

Пример 1, Для производства

L-лизина в лабораторных условиях используют измельченное некондиционное пшеничное сырье в соотношении с водой, равном 1:4, Пшеничный замес разваривают при давлении 0,15 ИПа в течение 1,5 ч охлаждают до 65 С и . стерильно задают культуральную жидкость Bacillus subtilis-82, содержащую L"aìèëaçó, в количестве 0,3%.

Предварительно культуру В.subtilis82 выращивают в колбах Эрленмейера ° объемом 750 мл на среде, содержащей

Х: кукурузная мука 9,0: кукурузный экстракт 2,5 (NHq) HP0 0,6; мочевина 0,4; мел 0,2, до достижения конца экспоненциальной фазы роста, что соответствует 32 ч от начала культивирования. Таким образом, культуру— продуцент L-амилазы задают в физиологически активном состоянии. Уровень активности L-амилазы 50 ед.

АС/мл культуральной жидкости. Первую стадию ферментативного гидролиза осуществляют в анаэробных условиях при периодическом перемешивании в течение 2 ч при 60 С до содержания редуцирующих углеводов 2Х. Расход амила- . зв| 1,3 ед. АС/г,крахмала. Наряду с гидролизом крахмала происходит частичное разрушение клеточной структуры продуцентов ферментов и выделение продуктов метаболизма в среду. На этой же стадии в среду стерильно задают подготовленные растворы ростовых веществ и солей, %: кукурузный экстракт 4,6; сульфат аммония 3,0; фосфат калия 0,1; сульфат магния

0 05; мел 2,0, рН среды доводят до

7,2, Затем температуру снижают до 30 С и стерильно засевают Brevibacterium

22 L — прадуцент L-лизина в количестве 6%, осуществляя культивирование микроорганизмов в аэробных условиях в колбах Эрленмейера объемом 750 мл одновременно с продолжающимся гидролизом крахмала.

Процесс биосинтеза лизина длится

66 ч. Выход лизина 20,0 г/л.

Пример 2. Подготовку источника углерода проводят аналогично примеру 1. Разваренное пшеничное сырье (сусло) охлаждают до 65 С и ведут ферментативный гидролиз, добавляя источник &амилазы по примеру 1 в количестве 0,6Х или 2,5 ед. АС/r крахмала сырья. Длительность ферментативного гидролиза составляет 1 ч, количество редуцирующих углеводов 3,0%.

Далее процесс осуществляют аналогич5 157656 но примеру 1. Длительность культивирования Brevibacterium 22 L составляет 65 ч. Содержание лизина в культуральной жидкости 27,0 г/л.

Предварительную культуру Geotriclium candidum Зс выращивают на среде, содержащей, 7: пшеничные отруби 2,0; свекловичный жом 2,0; однозамещенный фосфат калия О, 1; сульфат аммония

0 15; сульфат магния 0,05; нитрат натПример 3. Подготовку источника углерода ведут аналогично примеру 1. Разваренное пшеничное сусло охлаждают до 62 С и ведут фермента- 10 тивный гидролиз, добавляя источник.

L-амилазы по примеру 1 в количестве

1,3 ед. АС/г крахмала сырья, а в качестве источника глюкоамилазы дополнительно вводят культуру Aspergillus 15

awamori ВУП в количестве 0,357.. Пред" варительно культуру Asp. awamori BYD выращивают на среде, содержащей осахаренное кукурузное сусло, до начала стаци °

Э

20 онарной фазы роста, что соответствует

96 ч от начала культивирования. Физиологически активная культуральная жидкость содержит фермент глюкоамилазу в количестве 150 ед. ГлС/мл. Расход глюкоамилазы составляет 3,0 ед.

ГлС/г крахмала. Ферментативный гидролиз ведут до содержания редуцирующих углеводов 3,87, Далее процесс осуществляют так же, как в примере 1. Длительность культивирования Erevibacte- 30

rium 22 L составляет 65 ч. Выход лизина 31,5 г/л, Пример 4..Процесс биосинтеза

L-лизина ведут аналогично примеру 1, только в качестве источника углеводов используют некондиционное ржаное сырье, а в качестве продуцента лизина — культуру Brevibacterium E-531, Длительность культивирования 68 ч, выход лизина 32,2 г/л. 40

Пример 5, В качестве источника углеводов используют некондиционное ржаное сырье, подготовку которого осуществляют аналогично примеру 4.

В качестве источника ростового факто- 45 ра вместо кукурузного экстракта используют БВК в количестве 27..

Ферментолиэат БВК готовят путем длительного протеолиза кормовых дрожжей комплексным ферментным препаратом

Протооризином Гх (КФП), содержащим

15 ед. ПС/мл. КПФ дозируют из расчета

5 ед. на 1 r БВК. Протеолиз осуществляют при рН 4,7, температуре 55 С, создавая оптимальные условия для действия протеаз, в течение 2 ч при периодическом перемешивании, .затем температуру снижают до 30 С и выдерживают в течение 16 ч.

6 6

Процесс подготовки питательной среды для засева Brevibactexium E-531 и культивирования проводят аналогично примеру 4. Длительность ферментации составляет 66 ч. Выход лизина

36,8 г/л.

Пример,6; В качестве основного источника углеводов используют некондиционное ржаное сырье. Подготовка и состав питательной среды аналогичны примеру 5. При проведении ферментативного гидролиза в качестве источника протеаз используют культуру Asp. oryzae 251-90, находящуюся в физиологически активном состоянии и содержащую, наряду с протеолитическими, амилолитические ферменты. Источником глюкоамилазы служит культура

Asp. awamori ВУ0, вводимая в процесс аналогично примеру 3. Культуру Asp.

oryzae 25t-90,продуцент протеаз и

L-амилазы предварительно выращивают на среде, содержащей, 7: ячменная мука 4,0; соевая мука 1,0, одноэамещенный фосфат калия 1,5, до начала стационарной фазы роста, что соответствует 36 ч от начала культивирования.

В физиологически активной культуре

Asp. oryzae 251-90 содержится 10 ед.

АС и 11 ед, ПС/мл культуральной жидкости, Культуру задают в количестве

1,27., что соответствует 1,2. ед. АС/r крахмала сырья и 4,0 ед, ПС/г белка.

Далее процесс осуществляется так же> как в примере 5. Длительность ферментации 66 ч, выход лизина 38,4 г/л.

Пример 7 ° В качестве источника углеводов используют некондиционное овсяное сырье.. Подготовка и состав питательной среды аналогичны примеру 5. При проведении ферментативного гидролиэа в качестве источника целлюлолитических ферментов вводят дополнительную культуру Geotrichum

candidum Зс в количестве 2,07, Источником глюкоамилазы служит культура

Asp, awamori ВУ0, L-амилазы — ВАС.

subtilis-82, вводимые в процесс аналогично примеру 3. Ферментативный гидролиэ компонентов сырья проводят при о

65 С в течение 1,5 ч до содержания редуцирующих углеводов 57., 1576566

Формула изобретения

Составитель О.Скородумова

Корректор С.Иекмар

Заказ 1830 Тираж 482 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина,101. рия 0,15, до начала стационарной фазы роста, что соответствует 50 ч от начала культивирования.

В культуральной жидкости Geotriehum candidum Зс содержится 1,0 ед.

0ХВ/мл (ОХВ - активность ферментов, осахаривающих хлопковое волокно).

Далее процесс осуществляют так же как в примере 6. Длительность фермен- 10 тации 68 ч, -выход лизина 39,9 г/л. ,. Введение целлюлопитичеЖхщ ферментов целесообразно при использовании ппенчатых зерновых культур, содержащих большое количество некрахмальных полисахаридов.

Пример 8. Процесс биосинтеза лизина ведут аналогично примеру 5, но на овсяном сырье и в среду перед посевом продуцента лизина в питательную среду добавляют стерильный раствор мелассы в количестве 2%. Длительность ферментации 68 ч,выход лизина 41,2 г/л.

Пример 9. Процесс ведут аналогично примеру 5, но перед посевом 25

"культуры — продуцента лизина в питательную среду добавляют стерильный раствор мелассы в количестве. 3%.. Длительность ферментации 66 ч, выход лизина 41,9 г/л.

Пример 10, Процесс ведут аналогично примеру 5, но перед посевом культуры — продуцента лизина в питательную среду добавляют стерильный раствор мелассы в количестве 4%. Длительность культивирования 66 ч, выход лизина 42,1 г/л.

1. Способ получения кормового L40 лизина, включающий ферментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья действием культуры — продуцента гидроРедактор Н.Рогулич: Техред Л.Сердюкова литических ферментов, добавление к полученной среде минеральных солей и факторов роста, засев среды культурой - продуцентом лизина и проведение процесса биосинтеэа лизина в оптимальных условиях, о т л и ч аю m, и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, крахмалсодержащее сырье предварительно разваривают, для его гидролиза используют культуру или смесь культур — цродуцентов ферментов в физиологически активном, состоянии, процесс гидролиза ведут до содержания усвояемых углево- дов в среде 3-7% прн 55-65 С, осуществляя одновременно с гидролиэом частичное разрушение клеток культуры - продуцента ферментов, затем полученную среду охлаждают до температуры, оптимальной для биосинтеза лизина, и процесс биосинтеэа лизина ведут одновременно с гидролиэом крахмалсодержащего сырья путем совместного культивирования клеток продуцента лизина и частично разрушенных клеток продуцентов ферментов.

2. Способ по и. 1, отличаюшийся тем, что, .с целью улучшения аэродинамических свойств среды для бкосинтеза лизина, в нее добавляют мелассу в количестве 2-4%.

3. Способ по пп. 1-2, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве продуцента лизина используют штаммы

Brevibacterium 22 Ь или Brevibacterium Е-531 °

4, Способ по пп. 1-3, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве культуры — продуцента гидролитическнх ферментов используют штаммы Bacillus

subtilis-82, Aspergillus awamori ВУ0, Aspergillus oryzae 251-90, Ceotrichum

candidum Зс или их смеси.