Способ получения @ -лизина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-лизина путем глубинного культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей мелассу в качестве источника углерода, гидролизат белково-витаминного концентрата, минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью повыщения выхода целевого продукта за счет предотвращения его потерь, вызванных фаголизисом, осуществляют смещанное культивирование продуцентов L-лизина видов Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium species.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК, З „„1 13975

4 (51) С 12 Р 13/08; С 12 Р 39/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 t!

) ГНФ (21) 3577821/28 — 13 . (22) 01.03.83 (46) 15,02.85; Бюл. Р 6 (72) Б. П. Карабеков, С. В. Кажоян, Э. M. Акопян, М. Б. Читчян, С. Ж. Арутюнян, Ф. Н. Тхруни и Э. В. Кузнецов (71) Армянский филиал Всесоюзного научноисследовательского института генетики н селск ции промышленных микроорганизмов (53) 577.15 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

N 496300, кл. С 12 Р 13/08.

2. Авторское свидетельство СССР

Р 213032, кл. С 12 P 13/08. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-лизина путем глубинного культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей мелассу в качестве источника углерода, гидролизат белково-витаминного концентрата, минеральные соли, отличающийся тем,что, с целью повышения выхода целевого продукта за счет предотвращения его потерь, вызванных фаголизисом, осуществляют смешанное культивирование продуцентов L-лизина видов

Corynebacterium glutamicum u Brevibacterium

species.

1139753

Таблица 1

Литическая активность фагов

I1Iтаммы

Brevibacteriurn sp

С. g lutamicum

11

НФ ЕФ ФВ ВВ

С.g lutamicum Т вЂ” 3

С. glutamicum 95

Brevibacterium sp. 22 L

+ + + +

Brevibacterium sp. Е 531

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению незаменимой аминокислоты L -лизина.

Известен способ получения Ьлиэина путем культивирования штамма-продуцента Brevi — 5

bacterium species в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей мелассу как источник углерода (11 .

Однако данный способ не предусматривает мер предотвращения потерь конечного продукта о в процессе ферментации в случае фаголизисных операций.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения L-лизина путем глубинного культивирования Corynebacterium

g1utamicum на питательной среде, содержащей мелассу, минеральные соли, гидролизат белково-витаминного концентрата (2) .

Недостатком этого способа является отсут- 20 ствие мер предотвращения потерь конечного продукта в процессе ферментаций в случае

1 фаголизисных операций, что снижает выход лизина.

Цель изобретения — повышение выхода 25 целевого продукта за счет предотвращения его потерь, вызванных фаголизисом.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения 1-лизина путем глуГаким образом, исходя из строгой родовой

c:ецифнчности изученных бактериофагов мож- 5р но проводить смешанное культивирование про. дуцентов вида С.91utamicum и Brevibacteriurn ь . дяя обеспечечения выхода конечного про» дукта за счет одной иэ используемых культур в случае возможного фаголизиса параллельной культуры.

Можно допустить возможность одновременного фаголиэиса обоих культур, однако веробинного культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей мелассу в качестве источника углерода, гидролиэат белково-витаминного концентрата, минеральные соли, осуществляют смешанное культивирование продуцентов L-лизина видов CorynebacterFum

glutamicum u Brevibacterium species.

Сущность способа заключается в следующем

В ходе изучения спектров литической активности фагов Corynebacterium 9 1utamicunr (МС вЂ” 1, МС вЂ” 2, МС вЂ” 3, МС-4) и Brevibacterl

um species (НФ, ЕФ, ФВ, ВВ), выделенных при производстве лизина на Чаренцаванском, Ливанском, Щебекинском и Обольском заводах, установлена их ствогая родовая специфичность. Так, фаги С,91итаписит лиэируют только штаммы С.glutamicum, а.фаги Brevibacterium ар. анализируют только штаммы

8revibacterium sp. (см. табл. 1 и 2).

В лабораторных опытах с применением мутагенных факторов (1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин, УФ-лучи) не удается получить мутантные фаги; активные одновременно к бактериям обоих видов — С.glutamicum u Brevibac—

terium sp.

В табл. 1 приведен спектр литической активности бактериофагов Clglutamicum u

Brevibacterium sp. ятность этого будет значительно ниже.

Еще меньшим будет вероятность одиовре менного фаголизиса находящихся в смеси ° обоих штаммов — продуцентов в случае смешанного культюирования.

В табл. 2 приведен сравнительный спектр литической активности бактериофагов С.glu—

tamicum u Brevibacterium sp., выделенных при производстве лизина.

1139753

Таблица 2

Штаммы бактерий

Бактериофаги

Brevibacterium sp

+ + + +++

ФР-37

+ Ф +++

РВР— 26

+ + + + + Ф

+ + + +++

+ + + +—

+ + + + +

АТСС 13032 Дикий тил

+ + + + +

+ + + + + +

Ф + + + + + + + + + — + + + + + + + + +

sp. 22L, — "—

sp. 22LD

+ + + + + + + + + +

+ .+ + +.+ + + + + +

Š— 531, Brevibacterium

: flavum

С-80 Пролин . — — — + + + + + + + + Ф - Ф

Т вЂ” 2 Гомосерин

+ +, + + + + Ф + + +

ATCC 14067 Дикий — — — — + + + + + + + + + Ф

П р и м е ч а и и a "+" — наличие лизиса;

"-" — отсутствие лизиса.

Продукт сннтеэнруем штаммом

E, glutamicum Т 3 Лизин

М вЂ” 08 Гистидин

ГА 8 Ориитин

1344 Глутаминовая кислота

АТСС 13286

АТСС 13237

Brevibacterium sp. Лизин

Ф 2

1 (.) В

11

-l

5=! 1

1139753

В табл. 3 приведены результаты ферментации L-лизина с применением смешанных культур С.g1utamicum и Brevibacterium sp. (n=30, р=095) в условиях заражения фагами обоТаблица 3

С ф

Монокультура С.g1utamicum Т вЂ” 3 (контроль) 28,710,5

Монокультура (контроль) 8 rev ibacter ium

sp. 22 1

27,9+0,5

Монокультура (контроль) Brevibacterium

sp. Е 531

32,1+0,6

Моно культура (контроль) С.g1utamicum Т вЂ” 3

+(МС вЂ” 2) 8,5+1,3

Монокультура (контроль) Brevibacterium

sp. 22 L

+(НФ) 6,9+1,2

Монокультура (контроль) Brevibacterium

sp. Е 531

+ (ЕФ) 7,2+1,4

Brevibacterium sp. 22L+

+ С.g1utami curn T — 3

+ (МС вЂ” 2) 28,8+0,32

С.g1utamicum Т вЂ” 3 +

+Brevibacterium sp. Е 531

+ (МС вЂ” 2) 29,2+0,26

С. g1utamicum Т вЂ” 3 +

+Brevibactprium sp. 22

Смешанная культура

+(НФ) 28,0+0,28

Смешанная культура

+ (ЕФ) 33,0+0,3

Смешанная культура

29,2+0,5

Смешанная культура

32,0+0,3

Мг го культура (энтроль ) С.g1utamicum PBP — 26

27,31-0,5

8,2+1,3 (МС вЂ” 2) С.g1utamicum 95

+(МС вЂ” 2) 25,0+0,8

5,8+1,6

С.g1utamicum ФР— 37

28,5+0,5

7,4+1,4

+-(MC — 2) Brevibacterium sp.22

27,0+0,5

Смешанная культура

Смешанная культура

С.g1utamicum Т вЂ” 3+

+Brev ibacter iu m sp. Е 521

С. g1utamicum Т вЂ” 3 +

+ Brevibacterium sp. 22 1

С.g1utamicum Т вЂ” 3 +

+Brevibacterium sp. Е 531 их видов мик1яя ргализмов, выделенных на произвопстве 1.-лизина. Заражение фагом осуществлялось в начале ферментации, множественность заражения 1,0.

1139753

Продолжение табл. 3 (НФ) 8,5+1,3

25,0+1,2

4,9+1,7

+ (НФ) Сглешанная культура

)) С. g lutamicum P8P — 2б

Brevibacterium sp. 22

+ (МС вЂ” 2)

+(НФ) 28,3+0,6

26,7+0,5

+ (МС вЂ” 2)

+(НФ) 23,5+0,5

27,5+0,5

С.g lutamicum 95

8revibacterium sp. 22

+(МС вЂ” 2) 29,5+0,2

22,7+0,6

+ (НФ) С.g lutamicum

ФР-37

+(МС вЂ” 2)

27,9+0,5

Brevibacterium sp.

22 +(НФ) 25,5+0,5

Brevibacterium sp. ° 22 LD

С.glutamicum PBP — 26

Brevibacterium sp. 22 L0

Как видно из этих результатов, накопление лизина в культуральной жидкости смешанных культур при заражении фагами находится 30 на уровне контрольных ферментаций, в то . время как ферментации, осуществленные с помощью одной из этих культур, при заражении теми же фагами давали накопление лизина в культуральной жидкости не более

8,5 г/л.

Таким образом, в предлагаемом способе получения L-лизина цель достигается 3а счет смешанного культивирования продуцентов лизина С.glutamicum> и Brevibacterium sp., ко. 4О торое позволяет завершить процесс ферментации L-лизина без потерь целевого продукта в случае фаголизиса всей популяции клеток одной иэ введенных в ассоциацию культур продуцента. 45

Способ осуществляют следующим образом.

Культуры продуцентов 1-лизина, например

С.glutamicum Т вЂ” 3 и Brevibacterium sp

Е531, после раздельного выращивания в .. колбах вносятся в равных объемах (1:1) в. посевиъге аппараты иэ расчета 002% посевного материала к объему питательной среды в аппарате. Питательная среда для выращивания смешанного посевного материала в посевных аппаратах имеет следующий состав%:

Меласса 4,5-5,0

Кукурузный экстракт 4,0

Натрий хлористътй 0,4

- Натр едкий техн.

42% (для доведения рН до 7,8 — 8,0) 0,4-0,5

Пропинол Б-400 . 0,17

Посевной . материал, состоящий из смешанной культуры обоих видов продуцентов, выращивается до достижения оптической плотности не менее 0,3, после чего передается для засева в производственные ферментеры с мелассной ферментационной питательной средой. Посевной материал вносится в количестве 1-3%.

Ферментационная питательная среда имеет соедующий состав%:

Мел асса 20,0 — 22,0

Гидролизат БВК 8,0-9,0

Аммоний хлористый 0,6 — 1,0

Аммоний фосфорнокислый двухзамещенный 0,04 — 0,045

Ферментацию проводят при 28 — 32 С, рН

Ь среды 6,8-7,3, аэрации и переь.ешивании в течение 60 — 65 ч. После окончания культивирования из культуральной жидкости выделяют

1-лизин известными методами или получают кормовой концентрат 1-лизина.

Пример 1. Культуры С.glutamicum

Т вЂ” 3 и Brevibacterium sp. E531 (или 221) выращивают на косяках мясопептонного агара в течение 20 — 24 ч при 28 — 32 С. Культуры смывают стерильным физиологическим раствором и полученные суспензии смешивают в равных объемах. Посевной материал вносят

9 1139753 10

Составитель В, Голимбет

Техред С.Мигунова

Корректор А, Ильин

Редактор Т. Веселова

Тираж 525

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 224/19

Подписное

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 из расчета 5% от объема среды и выращивают

B колбах Эрленмейера 250 мл с 10 мл среды на качалке при 28 — 32 С в течение 72 ч для биосинтеза лизина. При этом для имитации условий возможного фаголизиса культуры продуцента вида С.g1utamicum биосинтез лизина проводят на фоне фага МС-1, лизирующего этот вид микроорганизмов, с концентрацией

85 10ь бое/мл, рН 6,8 — 7,2.

Состав ферментационной среды,%:

Мел асса 20,0 — 22,0

Гидролиэат БВК 8,0-9,0

Аммоний хлористый 0,6-1,0

Аммоний фосфорнокислый двухзамещенный 0,04 — 0,045

В конце ферментации содержание L-лизина в культуральной жидкости составляет 30,0—

35,0 г/л. Биосинтез осуществлен ассоциативной культурой В ген ibacterium sp. Е 531 (221) .

II р и м е р 2. Процесс осуществляется согласно примеру 1. В качестве фагового фона используют фаг ЕФ (или НФ), лизирующие культуры вида Brevibacterium sp. с концентрацией 5,3 10 бое/мл. Выход лизина в конце ферментации 30,0 — 35,0 г/л. Биосинтез лизина осуществлен ассоциативной культурой

С. g1utamicum Т вЂ” 3.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет по сравнению с известным повысить

l5 выход лизина до 30,0 — 35,0 г/л в то время как в случае фаголизиса выход составляет не более 8,5 г/л..