Способ получения трасформированных клеток двудольных растений

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии растений. Целью изобретения является повышение выхода нормальных трансформированных растительных клеток. Способ заключается в том, что конструируют плазмиды PMON 41, PMON 113, PMON 109, расщепляют их эндонуклеазами до образования целевых фрагментов, лигируют полученные фрагменты с образованием промежуточного вектора PMON 120. Плазмиду PMON 128 (или любую другую плазмиду, полученную путем включения химерного гена PMON 120) вводят в AGROBACTERIUM TU MEFACIENS,содержащие TI плазмиды. Контегративные плазмиды переносят в растительные клетки, отбирают трансформированные растительные клетки и выращивают трансформанты на среде до образования приростков.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (5!)5 С 12 N 15/00 г 1

ИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПИСАН

К llATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3701 78 7/30-13 (22) 16. 01.84 (31) 458402 (32) 17.01.83 (33) US (46) 30.07.90. Бюл. 1(28 (71) Монсанто Компани (US) (72) Роберт Томас Фралей, Роберт Брус

Хорш, Стиви Гэри Роджерс (US) (53) 575,224.2:577.2(088.8) (56) Ti plasmids and Directed Genetic

Engineering Molecular Biology of

Plant Pumor, изд. С Kahl and G ° S.

Schell, 1982, р. 537-548. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИУ. ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ДВУДОЛЬННХ РАСТЕНИЙ (57) Изобретение относится к биотехно логии, в частности к генетической инИзобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии растений.

Целью изобретения является повышение выхода нормальных трансформирован, ных растительных клеток.

Конструируют ряд плазмид, pMON 41, с правым краем Ti плазмиды нопалинового типа и 5 участком ге- . на нопалинсинтазы (ИО$), pMON 109 с

3 участком NOS гена, и селектируемым маркерным геном /Spc/Str/, который позволяет осуществлять селекцию клеток А. tumefaciens, содержащих коинтегративные Ti плазмиды с химерическими генами, pMON 113 с участком

ДНК, последовательность которой иден2 женерии растений, Целью изобретения является повышение выхода нормальных

Ъ трансформированных растительных клеток. Способ заключается в том, что

- конструируют плазмиды рМОР, 41, pMON

113, pMON 109, расщепляют их эндонуклеазами до образования целевых фрагментов, лигируют полученные фрагменты с образованием промежуточного вектора pMON 120. Плазмиду pMON 128 (или любую другую плазмиду, полученную путем включения химерного гена рМОМ 120 вводят в Agrobacterium tumefaciens, содержащие Ti плазмиды, Контегративные плазмиды переносят в растительные клетки, отбирают трансформированные растительные клетки и выращивают трантрансформанты на среде до образования приростков. тична последовательности в участке

Т-ДНК Т плазмиды октопинового типа.

Каждую плазмиду расщепляют эндонуклеазами до получения целевого фрагмента, Лигируют полученные фрагменты и получают промежуточный вектор

PHON 120, Плазмида pMON 120 обладает следующими характеристиками, Имеет три уникальных сайта рестрикции (Есо 21, С1а I, Hind III), реплицируется в нормальных клетках

Е, cali. Однако не реплицируется в нормальных клетках Agrobacterium, без коинтеграции с другой плазмидой, например Ti плазмидой, которая реплицируется в клетках Agrobacterium.

1582990

Несет маркерный ген, который кодиурет фермент, придающий устойчивость к двум антибиотикам, спектиномицину (5рс) и стрептомицину (Str) °

Этот ген, названный Spc/Str ген, экс5 прессируется в E coli и А. tumefaciens, но не в растительных клетках, не несет генов, которые кодируют устойчивость к ампициллину или тетрациклину, Содержит последовательность, которая гомологична последовательности в участке Т-ДНК октопинового типа Ti плазмиды.А. tumefaciens. Эту последо- 15 вательность называют "левый внутренний r омол огич е ский" (ЫН) уч а с то к, Этот участок гомологичности промотирует акт скрещивания, в результате которого PHON 1.20 или такая производная pMON 120, как pMON 128, образует коинтеграт с Ti плазмидой, если обе плазмиды существуют внутри одной и той же клетки A..tumefaciens. По определению "коинтегративная плазмида" образуется при простом акте скрещивания. Она содержит все последовательности ДНК, которые ранее существова.— ли либо в Ti плазмиде, либо в плазмиде, полученной из pMON 120, Содержит "правый крайний участок"

IТ-ДНК нопалинового типа,, т.е. после.— довательность, которая способна функ ционировать, как один конец (для удоб ства обозначаемый, ка.к правый край)

Т-ДНК последовательности, которая. пе- 35 ренесена из Ti плазмиды,и включена в хромосому растительной клетки в процессе трансформации клетки при помощи

A. tumefaciens.

Несет ген„(включая промотор), кото "0 рый кодирует экспрессию фермента, нопалинсинтазы (NOS), Будучи введен в растительную клетку NOS фермент катализирует продуцироваиие нопалина, типа опина.

Часть коинтегративной Ti плазмиды (модифицированньй участок Т-ДНК) вклю чается в растительный геном, т.е. только часть полученной из pMON 120 пла.з миды включается Ь растительный геном.,50

Эта часть начинается с крайнего участка Т-ДНК и простирается в одном направлении только до участка гомологич- ности.

Размер плазмиды pMON 120 составля«55 ет около 8 тыс. оснований, Нопалинового типа Ti плазмиду, обозначенную как pTi 137 плазмиду, расщепляют Hind III эндонуклеазой до получения различных фрагментов, включая фрагмент размером 3,4 тыс. оснований, который. обозначен max Hind

Ш-23 фрагмент. Этот фрагмент содержит целиком NOS ген и правый крайний участок T-ДНК, Включают Hind III-23 фрагмент в плазмиду pBR 327, Полученную плазмиду обозначают рМОИ 38 и расщепляют ее, В результате получают фрагмент размером 2,3 тыс. оснований, который содержит правый крайний уча-! сток нопалинового типа и 5 участок

NOS гена (включая промоторный участок, 5-нетранслированный участок и часть структурной последовательности).

Этот фрагмент размером 2,3 тыс. оснований включают в плазмиду рВР. 327, которую заранее расщепляют Hind III и Bam HI. Полученную плазмиду обозна чают pMOJ 41.

Плазмида pMON 109 включает Spc/Str селектируемый маркерный ген и 3 участок NOS гена до рМОМ 120, Ее конструируют следующим образом, Ппазмиду pMON 38 расщепляют Rsa I, в результате чего получают тупые концы, как указано: 5 -С ТАС, CAT G.

Выделяют фрагмент размером 1,1 тыс. оснований и расщепляют Bam HI до получения фрагментов размером 720 и

400 пар оснований, каждый из которых имеет один тупой Rsa конец и липкий

Bam HI конец, Эти фрагменты добавляют к двунитевой ДНК из фага M13mp8, которую расщепляют Sma I (которая дает тупые концы) и Bam HI. Полученную смесь лигируют, трансформируют в клетки, Рекомбинантные фаги ДНК, которые содержат фрагмент размером

720 пар идентифицируют размером вставки Bam HI-Sma I.

Один из этих фагов обозначают как

М-4. фрагмент размером 720 пар оснований содержит 3 -нетранслированный участок (включая сигнал поли-аденилирования) БОБ гена и 3 участок структурной последовательности NOS гена, фрагмент размером 720 riap оснований окружена в M — 4 Есо RI u Pst I сайтами расщепления, которые присутствуют в М13 mp8 ДНК.

Бактериальный транспозон Тп 7, как известно содержит Spc/Str ген, упомянутый ранее, Тп 7 транспозон содержит также ген, который вызывает у клеток хозяина устойчивость к антибиотику триметоприму. Точное располо158 2990 6 жение и ориентация Spc/Str гена и на и ге- Ti плазмидой, Участок гомологичности на устойчивости к триметоприму в Тп 7 неизвестны. Транспозон Тп 7 выделяют выбирают иэ Ti плазмиды октопиновогоА Е из штамма . tumefaciens, в котором типа. В Ti плазмиде он расположен

Тп 7 бы включе в участок Hind III-23 5 Д » плаэмиды РТ1 Т37. внутри Т"ДНК участка Ti плазмиды.

Ппаэмиду pGV 3106 расщепляют

Этот участок гомологичности обозначаII

Hind III и фрагменты клонируют в ют как левыи внутренний участок гомоpBR 327 плазмиды расщепленную»в d в логичности" (LIH).

III; Полученные плаэмиды включают в

Участок гомологичности получают

Е. col i клетки, отбирают клетки коиэ любого типа плазмиды, способной

t торые были устой ивы к ампи ину .. тР нсфоРмиРовать Растительные клетки. (благодаря pBR 327 гену) и устойчивы Конструируют промежуточный вектор ° к риметоприму (благодаря гену Тп 7). котоРый может обРазовывать коинтегративную пла миду с тем типом плазмиl5 Д нии, обозначают как pMON 31. В этой ды, из которой бып получен участок плазмиде copepKHTcs BcTaBKa 6 нований Hind III. Вставка содержала Получают Е. coli культуру с РВР,ген $рс/Str — устой ивости,и ген ус- производной плаэмидой содержащей

20 в тойчивости к триметоприму иэ Тп 7 и

Bam-8 фрагмент Ti плазмиды октопинов

3 участок гена !,,0$ (который попал из вого типа, Ваш-8 фРагмент РазмеРой

pTi Т37 плазмиды), 7,5 тыс. оснований содержит левый

Размер плаэмиды pMON 31 уменьшают кРайний Участок и ЫН Участок Т1 дважды. Вначале уменьшение размера и а плазмиды, Bam-8 фрагмент включают в производят за счет расщепления плаз- плазмиду РВЕ 327в которую расщепляют миды Eco PI, удаляют фрагмент размером 850 пар о„,.ваний и ос, ествляют П"аз "дУ PMON 90 РасщеплЯЮТ Bgl II н а rIO и фРагмент Размером 2,6 тыс. основа-. лученную плаэмиду обозначают как ний, который содержит участок LIH, но

РМО»» 53 вьщеляют иэ трансформирован- не содержит левый крайний участок ных еток, выбранных по их устойчи- вьщелЯют. ФРагмент РазмеРом 2вб тыс. вости к ампициллину и стрептомицину. оснований обрабатывают полимеразой

Устойчивость к триметоприму не опреКленова для превращения липких концов деляют, Размер плазмиды pMON 53 умень тУпье концы и полУченный фРагмент шают путем расщепления плаз,„ды С1а I 35 Рас епляют Hind III до получения фра и удаления фрагмента размером 2 тыс. ме нта размером 1, 6 тыс. оснований (цепар оснований и с вки заново кр но- левон фрагмент) и фрагмента размером

ro фрагме та, Полученную плаз ду . 1 тыс. оснований. Оба фрагмента смеразмером 5,2. tblc оснований обознашивают с РВР. 322 плазмидой, которую чают как рМОМ 54. Эта плаза содер- 40 заранее расщепляют Pvn II u Hind Ш. жит $рс/ tr ген, Полученную смесь смешивают и включают ! в клетки Е. cali. Клетки отбирают на

Плазмиду РМОь! 54 расщепляют Есо RI устойчивость к ампициллину и проводят и Pst I и выделяют фрагмент размером поиск Sma I сайта, который находится

4,8 тыс. оснований, содержащих 45 во фрагменте размером 1,6 тыс. осноSpc/Str ген. М-4 ДНК расщепляют Есо RI ваний и которого нет во фрагменте раз и Pst Х и выделяют фрагмент размером мером 1 тыс. оснований. Колонию.с це740-пар оснований, содержащий NOS Зв - левой плаэмидой идентифицируют и плаз нетранслированный участок. Эти фраг- миду иэ этой колонии обозначают менты сшивают вместе до образования 5p pMON 113.

РМОЫ 64, Плазмиду с нужной ориентаци- Плазмиду pMON 41 расщепляют Pvn Х ей идентифицируют путем расщепления и Bam I и выделяют фрагмент 1,5 тыс °

Есо PI u Bam HI, Их обозначают как оснований, содержащий правый крайний

pHON 109 а участок нопалинового типа и 5 участок

Плазмида РМО»» 113 содержит участок 55 NOS гена, Плазмиду РМОМ 109 расщепляют гомологичности с РМОИ 120, который Ваш HI и Есо PI и выделяют фрагмент позволяет pMON 120 образовывать коин- 3,4 тыс. оснований, содержащий ген: тегритивную плазмиду, если она при- $рс/е и 3 участок гена NOS, Плаэмисутствует в А. tumefaciens вместе с ду pMON 113 расщепляют Pvn I и Есо P.Т

1582990

H выделяют фрагмент размером 3,1 тыс. оснований, содержащий участок ЫН.

Эти три фрагмента смешивают вместе и сшивают до образования pI!ON 120, Культуру бактерий Е. col i содержащую

pMON 120, депонируют н Американской коллекции типовых культур под !! - 39263.

Способ применения рМО1! 120.

Плазмида р! !ОИ 120 имеет три уни.—

10 кальных сайта расщепления (Есо РХ, Cla I u Hind III), которые пригодны для включения любого необходимого гена. Эти сайты расщепления расположены в участке р!".ON 120, который должен быть включен в растительный геном, так что включенный ген также будет включен в растительный геном.

Конструируют различные химерные гены, которые способны к экспрессии бактериальных полипептидон и полипеп,тидон млекопитающихся н растительные клетки.

Конструируют химерный ген, который включает следующие ДНК последователь- 25 ности.

Промоторный участок и 5 нетрансли рованньп участок, полученный из гена нопалинсинтазы (Г!ОЯ), Структурную последовательность, полученную из гена неомицинфосфотрансферазы П (NPT II).

3 нетранслированньп! участок, полу1 ченньп из гена NOS, Этот химерный NOS-NPT II-NOS ген выделяют íà ДНК фрагменте, содержащем

Есо PI концы. Включают его в Есо RT.

35 сайт плазмиды р1!011 120 и полученные плазмиды (с вставками химерического гена противоположной ориентацией) обозначают как рМОМ 128 и pMON 129.

Щ

Плазмида pMOIJ 129 имеет дне копии химерного гена, Каждук плазмиду исполь- зуют для трансформации растительных клеток. Культуру Е. coli, содержашую

pM0N 128, депонируют н Американскую

45 коллекцию типовых культур, Этой культуре бып присвоен регистрационный номер 39264, I

Плазмиду pMON 128 (или любую дру-у гую плазмиду, полученную путем вклю-. чения целевого гена в pMON 120) вводят в микроорганизм, который содержит

Ti плазмиду октопинового типа (или другую подходящую плазмиду) . Подхоцящие микроорганизмы включают А. tume55 .faciens и А. rhirogenes,, которые содержат Т или Ri плазииды.

Плазмиду вставляют в микроорганизм трансформации или конъюгацией с клетками, которые содержат pMON 128 или другие плазмиды. Плазмида, такая как рМОИ 128 имеет участок, который гомологичен последовательности н Ti плазмиде, Этот участок LIH гомологичности позволяет осуществлять единичный акт скрещивания, в результате которого рМРМ 128 и Ti плазмида октопинового типа объединяются с образованием коин тегративной плазмиды, Обычно зто происходит с клеткой А. tumefaciens после того, как р1!ОЫ 128 бывает включена н клетку. В другом варианте коинтегративную плазмиду создают в клетке другого типа или in vitro, включают н

А, tumefaciens или клетку другого типа, которая способна перенести коинтегративную плазмиду в растительные клетки, Плазмиду, такую как рМОН 128, объединяют с Тх плазмидой с получением коинтегративной плазмиды б, Культуру

A. tumefaciens GV 3111, содержащую коинтегратинную плазмиду, полученную из pMON 128 и Ti плазмиды дикого типа pTi 8653,депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39266.

Если коинтегративную Ti плазмиду включают и растительную клетку, то н растительный геном может войти любой из двух участков ДНК, Т-ДНК,участок

14 или T-ДНК 16, Разрабатывают альтернативный способ, н котором избегают необходимости отделять опухоленые клетки от неопухолевых клеток. Выцеляют некоторые мутантные штаммы А, tumefaciens, которые неспособны вызывать заболевание верхушечной галловой опухоли. Такие штаммы обычно называют "безоружные"

Ti плазмиды. Ti или Рi плазмиды могут быть "обезоружены" н результате одного или более типов мутаций. После того, как рМО1! 128 включают в А. tumefaciens клетки, нужный акт скрещивания будет происходить в определенных участках клетки. Клетки, которые соцержат коинтегративные плазмиды (незанисимо от того, вирулентные или обезоруженные) отбирают от других клеток, н которых скрещивание не происходит, следующим образом. Плазмида рИО11 120 и ее производные содержат ,маркерный ген (Spc/str), I

mefaciens. Поэтому spc/str маркерный

9 1582990 . 10 ген не наследуется стабильно в А. tumefaciens, если только включенная плазмида не объединится с другой плазмидой, которая может реплицироваться в A. tumefaciens. Наиболее вероятной

5 такой комбинацией за счет участка гомологичности является коинтеграция с Ti плазмидой. Клетки А. tumefaciens которые содержат такую коинтегративную плазмиду, идентифицируют и отбирают при выращивании клеток на среде, содержащей либо Spc, либо str, либо оба вместе, Возможен вариант, когда коинтегра- 15 тивная Ti плазмида претерпевает по» следовательный акт скрещивания, в котором два участка LIH будут рекомбинироваться, Такой акт нежелателен, так как он может привести к делению

ДНК между ЫН участками, содержащей

20 химерический ген. Однако это повидимому не приводит к серьезным затруднениям по двум причинам. Во-первых, такой акт повидимому происходит с от- 25 носительно невысокой вероятностью, примерно около 10, Во †втор, плазмиду PHON 120 и ее производные конструируют таким образом, что селектируемьй маркерный ген (spc/str) расположен в области ДНК, которая будет исключена при акте скрещивания. Поэтому селективные условия, которые используются для идентификации.и-. культивирования клеток Agrobacterium 35 содержащих коинтегративные плазмиды, должны быть достаточно жесткими для того, чтобы убить поколения клеток, которые претерпевают последующий акт скрещивания, который исключает химерический ген из Тх плазмиды.

Только один из LIH участков в коинтегративной Ti плазмиде будет включен в растительньй геном.

Эта ватная особенность определяет- 45 ся конструкцией рМОЕ 120 и именно она отличает эту коинтегративную плазмиду от нежелательных коинтегративных плазмид, которые получали ранее. Участок IF., KQTopblH расположен вне 5

Т-ДНК крайних участков, не будет включен в растительный геном. Это . приводит,по крайней мере,к двум важным преимуществам. Во-первых, наличие двух участков IH включенных в расти55 тельный геном, может привести к актам скрещивания, которые приведут к потере включенных генов. в трансформиро ванные клетки и их потомство. Во-вторых, наличие двух участков ДНК гомо-г логичности может значительно затруднить попытки анализа,ННК вставок в растительный геном.

Клетки А. tumefaciens, которые содержат коинтегративные Ti плазмиды с химерическими генами, идентифицируют и выделяют. Коинтегративные плазмиды включают в растительные клетки, которые подлежат трансформированию, под- вергают контактированию с ферментами, которые удаляют клеточные стенки. Это превращает растительные клетки в протопласты, которые представляют собой жизнеспособные клетки, окруженные мембранами. Эти ферменты удаляют и протопласты начинают регенерировать материал клеточных стенок. В подходящий момент времени клетки А. tumefaciens (которые содержат коинтегративные Ti плазмиды с химерическими генами) смешивают с растительными протопластами. Эти клетки совместно культивируют в течение промежутка времени, которьй позволяет А; tumefaciens инфицировать растительные клетки. После соответствующего периода совместного культивирования клетки

A. tumefaciens убивают и продолжается рост растительных клеток.

Трансформированные растительные клетки отбирают различными способами, в зависимости от типа гена (генов), которые быпи включены в растительньй геном, I

Пример 1. Конструирование плазмиды рМОИ 41 °

Используют культуру E. col i содержащую pBR 325 плазмиду с Hind III23 фрагментом pTi Т37, включенным по

Hind III сайту. 10 мкг плазмиды из этого клона расщепляют !О ед. Hind III эндонуклеаэы в течение 1 ч при 37 С.

Фрагмент 3,4 тыс. оснований Hind III23 выделяют адсорбцией на стеклянных шариках после отделения от других

Hind III фрагментов электрофорезом на 0,87-ном агарозном геле. Выделенный 3,4 тыс, оснований Hind Ill фрагмент (1,0 мкг) смешивают с 1,О мкг плазмиды pBR 327 ДНК, которую заранее расщепляют Hind III эндонуклеазой (2 ед., 1 ч, 37 С) и щелочной фосфатазой теленка (0,2 ед,, 1 ч, 37 С), депротеинизируют фенолом, осаждают этанолом и повторно суспендируют в

10 мкл ТЕ (10 мМ трис НС1, рН 8 r, 1 мМ ЭДТА). С!дну единицу Т4 ДНК лигаО 12 предварительно Расщепляют Sma I u

Bam HI (каждой по 2 ед. 1 ч, 37 С и

0,2 ед. телячей щелочной фосфатазы) .

После сшивки ro 100 ед. Т4 ДНК лигазы и трансформации Е. coli J M101 клеток, трансформированные клетки смешивают с мягким агаром и высевают в чашки в условиях, которые позволяют идентифицировать рекомбинантный фаг, Отобрали двенадцать клеток, продуцирующих рекомбинантные фаги и получаюг мини-препарат RF плазмид, RF ДНК расщепляют Bam HI u Sma I для доказательства наличия Rsa I — Ваш HI фрагмента размером 720 пар оснований. Одну из рекомбинантных RF ДНК, несущую . нужный фрагмент, обозначают М13 мр8

М-4 .

Пример 3. Двадцать мкг пла« змиды pGU 3106 расщепляют Hind III эндонуклеазой (20 ед., 2 ч, 37 С) и смешивают с 2 мкг pBR 327 расщепленной Hind III. После лигирования (Т, ДНК лигаза, 2 ед.) и трансформации

Е. coli клеток, как описано ранее получают одну колонию, устойчивую к триметоприму (100 мкг/мл) и ампициллину, Обработка плазмидной ДНК из этой клетки демонстрирует наличие

Hind III фрагмента размером 6 тыс. оснований. Эту плазмиду обозначают

РМОУ, 31.

Плазмиду рМ01Т 31 расщепляют Есо RI о эндонуклеазой (1 ед., 1 ч, 37 С), Эндонуклеазу инактивируют нагр,еванием (10 мин, 70 С) . Плазмидный фрагмент размером 8,5 тыс. оснований рециркулируют в реакции лигирования 100 мкл (Т4 ДНК лигаза, 1 ед.) и используют для трансформации клеток Е. coli c отбором устойчивых к ампициллину и стрептомицину (25 мкг/мл) колоний.

Плазмидный мини-препарат ДНК из шести клонов расщепляют Есо RI для определения потери фрагмента 850 пар оснований. Одну плазмиду, у которой не было Eco RI фрагмента 850 пар оснований обозначают pMON 53. Эту плаз« миду вводят в Е. coli GM42 дам-клетки (Balectal 1979) описанной трансформацией.

Плазмиду pM01 53 (0,5 мкг) из ми" ни-препарата, полученного из клеток, расщепляют С1а I и рециркулируют в разбавленном растворе. После трансформации Е. coli СМ42 клеток и отбора устойчивых к ампициллину и спектиномицину (50 мкг/мл) клонов, получают

11 158299 зы добавляют к фрагментированной смеси. Одну единицу определяют, как концентрацию, достаточную для получения более чем 907. циркуляризации одного микрограмма Hind III линеаризованной

pBR 327 плазмиды за 5 мин при 22 С,.

Смешанные фрагменты помещают в полный объем 15 мкл 25 мМ трис НС1 РН 8, 10 мМ MgC1,, 1 мМ дитиотреитола, 200 мкМ спер мидина НС1 и 0,75 мМ ATP (лига з ный буфер) .

Полученную смесь инкубируют при

22 С в течение 3 ч, а затем смешивают о с етка Е. Coli С 600 гес А56, ко 15 торые получают трансформацией путем обработки СаС1,. Для отбора трансформированные клетки распределяют íà ZB пластины с твердой средой, содержашие ампициллин при 200 мкг/мл, После инку- 20 бирования при 37 С в течение 16 ч получают несколько сотен клонов ° Плазмидные мини-препараты выделяют из 24 клонов и полученные аликвоты плазмидной ДНК (О, 1 мкг) расщепляют Hind III 2 для того, чтобы продемонстрировать наличие 3,4 тыс. оснований Hind ХХХ фрагмента, Однако из плазмид демонстрируют ожидаемую структуру и обозначают pMON 38 °

ДНК получают с помощью тритон Х- 100 лизиса и градиента Cs01, 50 мкг

pMON 38 ДНК расщепляют Hind III u Bam HI (50 ед. каждая, 2 ч, 37 С), H Hind III-.

Bam HI фрагмент размером 2,3 тыс. оснований выделяют. Выделенный фрагмент 35 (1 мкг) смешивают с 1 мкг фрагмента

Hind ХХХ-Ваш НЕ размером 2,9 тыс. оснований pBR 327 вектора. После лигирования (Т4 ДНК лигаэа, 2 ед,) и трансформации Е. coli клеток получают

50 ампицилинустойчивых колоний. ДНК иэ двенадцати плазмидных мини-препара тов расщепляют Hind III u Bam НХ для установления наличия фрагмента размером 2,3 тыс, оснований. Одну плаз45 миду нужной структурЬ выбирают и обозначают pMON 41.

Пример 2, Тридцать мкг плазмиды pMON 38 расщепляют Рза Х (30 ед. 5р

2 ч, 37 С) и 1100 пар оснований Rsa Х) фрагмент выделяют после разделения электрофорезом на агарозном геле, используя метод стеклянных шариков, I фрагмент 1100 пар осно ваний (1 мкг) расщепляют 2 ед. Ваш HI эндонуклеазы и Bam HI инактивируют нагреванием. Эту ДНК смешивают с

0,2 мкг фага М13мр8 RF ДНК,, который

l3

14 пятьдесят колоний. Расщепление плазмидных мини-препаратов ДНК из шести колоний показывает, что во всех отсутствует фрагмент размером 2 тыс. основании Cla 1. Одну из этих плазмид

5 обозначают pMAN 54. Получают плазмидную ДНК, Плазмиду pMON 54 ДНК (20 мкг) расщепляют Есо RI u Pst I эндонуклеазами (20 ед. каждого, 2 ч, 37 С) и фраг о

10 мент размером 4,8 тыс, оснований очищают на агарозном геле, используя мембр аны NA-45 .

Очищенный фрагмент размером

4,8 тыс. оснований (О, 5 мкг) смешивают 0,3 мкг фрагмента размером

740 пар оснований Eco RI — Pst I, полученного из М13мр8 М-4 RF ДНК, которую очищают, используя мембрану

NA-45. После лигирования (Т4 ДНК ли20 газа, 2 ед.), трансформации E. coli . GM42 дам-клеток, и отбора клеток, устойчивых к спектиномицину, получают 20 колоний, Плазмидный мини-пре- 25 парат ДНК, полученный из 12 клонов, расщепляют Pst I и Есо RI для демонстрации наличия фрагмента 740 пар оснований. Одну плазмиду, несущую этот фрагмент обозначают pMON 64.

ДНК (0,5 мкг) рМОН 64 расщепляют

Cla I (1 ед,, 1 ч, 37 С), затем Cla I инактивируют нагреванием и фрагмент заново присоединяют Т4 ДНК лигазой (1 ед.). После трансформации и отбора клеток, устойчивых к спектиномицину, получают мини-препарат из 12 колоний.

ДНК расщепляют Bam Н? и Есо RI для определения ориентации фрагмента

2 тыс. оснований Сlа I. Половина клонов. содержит Сlа I фрагмент в обрат40 ной ориентации нежели в pMON 64. Одну из этих плазмид обозначают pMON 109, Пример 4. Принимают плазмиду pNW 31С вЂ” 8,29С. Плазмида несет

pTi А6 7,5 тыс. оснований Bam 8 фраг45 мент, Ваш-8 .фрагмент выделяют из

50 мкг Bam HI — расщепленной плаэмиды рМ4 31С вЂ” 8 290, используя NA-45 мембрану, Очищенный Bam-8 фрагмент размером 7,5 тыс. оснований (1,0 мкг) смешивают с 0,5 мкг pBR 327 векторной

ДНК, которую предварительно расщепляют эндонуклеазой Bam HI (2 ед ) так и 0,2 ед, щелочной фосфатазы теленка в течение 1 ч при 37 С, полученную

55 смесь депротеинизируют и повторно суспендируют. Смешанные фрагменты обрабатывают Т4 лигазой (2 ед.), используют для трансформации E coli С600

ГЕСА клеток, отбирают колонии, устоЁчивые к ампициллину. Мини-препарат для получения плазмидной ДНК вьщеляют из двенадцати этих клонов, ДНК расщепляют с Bam HI для i ого, чтобы продемонстрировать наличие pBR 327 вектора и Йаш-8 фрагментов размером

7,5 тыс, оснований. Одну из плазмид, в которой имелись оба эти фрагмента., обозначают pMON 90, 25 мкг pMON 90 ДНК расщепляют

Bgl II (25 ед., 2 ч, 37 С) и Bgl II фрагмент размером 2,6 тыс. оснований очищают, используя NA-45 мембрану.

Для создания тупых концов фрагмент (2 мкг) повторно суспендируют в 10 мкл

50 мМ ИаС1, 6,6 мМ Трис-НС1 рН 8, 6,6 мИ MgC1, и 0,5 мМ дитиотритола (буфер Кленова). 4 деоксинуклеозидтри фосфатазы (dATP, dTTP, dCTP и dCTP) добавляют до конечной концентрации

1 мИ и добавляют одну единицу большого фрагмента Кленова ДНК полимеразы

1 Е. coli, После инкубирования в течение 20 мин при 22 С, полимеразу

Кленова инактивируют нагреванием и добавляют 10 ед. Hind III Расщепление Hind III проводят в течение 1 ч о при 37 С и затем фермент инактивируют нагреванием, Добавляют тупые фрагменты Hind III — Bgl II (1 мкг) к 0,25 мкг

Hind III — Pvu II фрагменту размером

2,2 тыс, оснований рВР, 322, KoTopblH получают путем расщепления Hind Ш и Pvu II, и затем обработки щелочной фосфатазой теленка, После лигирования с использованием 100 ед, Т4 ДНК лигазы, трансформации Е ° coli ZE392 клеток .и отбора устойчивых к ампициллину колоний, получают девятнадцать колоний. Плазмидные мини-препараты получают из двенадцати колоний и расщепляют Hind III для определения размера рекомбинантной плазмиды и Sma Х для определения правильности включения,фрагмента, Одну плазмиду с правильной структурой обозначают pMON-113.

Пример 5 ° Двадцать мкг плаэмиды pMON 109 расщепляют Есо RI u

Bam HI (по 20 ед, каждой, 2 ч, 37 С) и Bam Н1 — Есо RI фрагмент размером

3,4. тыс, оснований очищают, используя

NA-45.мембрану, 20 мкг плазмиды рМО>1 41 расщепляют Bam HI u Pvu I (20 каждой, 2 ч, 37 С) и Bam HI—

Pvu I фрагмент размером 1,5 тыс, ос1582990 нований очищают, используя NA-45 мем-! брану, 20 мкг pMON 113 ДНК расщепляют

PVu I и Есо RI (по 2 ед. каждой, 2 ч, 37 С) и Pvu 1 — Есо RI фрагмент разо S мером 3, 1 тыс, оснований очищают, используя NA-45 мембрану; Для сборки плазмиды рМОГ! 120 Есо RI — Pvu I фрагмент размером 3,1 тыс. оснований рМОГ! 113 (1,5 мкг) смешивают с

1,5 мкг фрагмента Есо RI — Bam HI размером 3,4 тыс. оснований из

pM0N 109. После обработки Т4 лигазой (3 ед.) в течение 16 ч при 10 С лигазу инактивируют нагреванием (1P мин

70 С) и добавляют 5 ед, Bam HI, Расщепление продолжают в течение 30 мин о при 37 С и в это время Bam НХ эндонуклеазу инактивируют нагреванием как и ранее. Затем. 0,75 мкг Pvu I - Bam НТ фрагмента размером 1,5 тыс, оснований из pMON 41 добавляют вместе с Т4 ДНК лигазой (2 ед.) и свежим АТР до конечной концентрации 0,75 мМ. Оконча- 25 тельное взаимодействие с лигазой проводят в течение 4 ч при 22 С и смесь используют для трансформации

Е ° coli ZE 392 клеток с последующим отбором клеток, устойчивых к спектиномицину, как описано ранее, Плазмидные мини-препараты из двенадцати из нескольких тысяч колоний скринируют для получения плазмид размером приблизительно 8 тыс, оснований, содердащих одиночные сайты Ваш НХ и

Есо RI, Одну плазмиду, которая имела нужную структуру, обозначают pMON 120, pMON 120 ДНК получают аналогично примеру 1, Культуру F.. col i содержащую pMON 120, депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39263.

Пример 6. Плазмида рМОГ! 75" содержит химерический NOS-NPTII-NOS

45 ген. Эту плазмиду и pMON 128 расщепляют Есо RI и очищают фрагмент размером 1,5 тыс. оснований, содержащий

NOS-NPTII-N0S-ген.

59

Плазмиду pMON 120 расщепляют Hco Rl и обрабатывают щелочной фосфатазой теленка. После фенольной депротеинизации и. осаждения этанолом Есо PI, отщепленную pMON 120 линейную ДНК

55 смешивают с 0,5 мкг размером 1 5 тыс, оснований Есо RI химерическим генным фрагментом pMON 75 или 76. Полученную смесь обрабатывают 2 ед, Т4 ДНК лигазы в течение ч при 22 С. После трансформации F,, coli клеток и отбора колоний, устойчивых к спектиномицину (50 мкг/мл), выявляют несколько тысяч колоний. П1есть из них отбирают, выращивают и готовят плазмидные минипрепараты. Плазмидные ДНК расщепляют

Есо RI для проверки на включение химерического гена размером 1,5 тыс. оснований и Bam HI для определения ориентации включения. Ваш HI расщепление показало, что в плазмиде рМОГ! 128 химерический ген транскрибируется. в том же самом направлении, что и интактный нопалинсинтазный ген рМОГ! 12Q. Культуру Е. coli, содержа".: щую pMON 128, депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39264.

Ориентация вставки в рМОГ! 129 противоположна ориентации в pMON 128, появление дополнительного фрагмента Ваш НХ размером 1,5 тыс. оснований Bam HI при расщеплении плазмиды pMON 129, свидетельствует о том, что плазмида

pMON 129 несет тандем дупликацией хи, мерического NOS-Г .РТ II-NOS гена.

Пример 7. Плазмиду рГ10Г! 128 переносят в хлор амфениколустойчивый

Agrobacterium tumefaciens" штамм

GV 3111-С58С1, несущий Ti плазмиду

pTi B65 3 tra<, используя методику скрещивания на пластине трех родителей, следующим образом. 0,2 мл культуры Е. colL несущей pMON 128,. смешивают с 0,2 мл культуры Е, coli штамма НВ101, несущего pRK 2013 плазмиду и 0,2 мл GV 311 клеток, Полученную смесь клеток культивируют в бульоне Луриа (LB) помещенном на 1В пластину, и инкубируют в течение 16-24 ч при 30 С, чтобы дать возможность осуществиться переносу плазмиды и образованию коинтегративных плазмид. Клет ки повторно суспендируют в 3 мл 10 мМ

MgSO q и затем 0,2 мл аликвотной части распределяют на LB пластине, содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола и по

100 мкг/мл спектиномицин и стрептомнцина, После инкубирования в течение

48 ч при 30 С получают приблизительно

10 колоний. Выбирают одну колонию и выращивают при 39 С в LB среде, содержащей хлорамфеникол, спектиномицин и стрептомицин в указанных выше концентрациях.

Готовят отдельный тип коинтегративной пла.змиды для использования в

1582990

Заявители использовал растворы в расчете на 1

Смесь ферментов

Целлюлизин

Макерозим

Ампициллин

КН, РО

КМОз

СаС1, MgSO 7 Нг О

KI

САБО 5 Нг О

Маннитол

МБ9 MS соли

Сахароза

Витамины В5

Маннитол

Фитогормоны

Бензиладенин (ВА)

2,4-р

MS — ES MS соли

Сахароза

Витамины В5

Маннитол

Карбенициллин

Фитогормоны

Индолуксусная кислота

MSO MS соли

Сахароза

Витамины В5

Питательная среда пла

М$ соли

Сахароза

Витамины В5

Маннитол

Фитогормоны и следующие л.

5 r

0,7 r

0,4

27,2 мг

101

1,48 r

246 мг

0,16 мг

0,025 Ъг

110 r

4,3

30,0 г

1 мл

90,0 г

25

0 5 мг

1 мг

4,3 r

30 r

1 мп

30 г

10 мг

О, 1 мг

4,3 r

30,0 r

1 мл стин

4,3 r

30,0 r

30,0 r

45

0,5 мг

4,3 r

30 r

1 мп

ВА

MS 2С MS соли

Сахароза

Витамины В5

Фитогормоны

Хлорфеноксиуксусная кислота

MS 104 MS соли

Сахароза

Витамины В5

55

2 мг

4,3 r

30,0 r

1 мп контрольном эксперименте путем включения рМОЫ 120 в клетки А. tumefaeiens и отбора клеток с коинтегративными плазмидами, исгользуя спектиномицин и стрептомицин. Аналогично pMON 120 эти плазмиды не содержат химерический

НОЯ-NPT-II-NOS ген.

Пример 8. Растворы, которые используют при культивировании расти- 10 тельных клеток.

Фитогормоны

0,1 мг

1 мг

4,3 г

30,0 г

1 мл

Расщейленную смесь сеют через сита 68, 74 и 88 меш для удаления крупных осколков и лиственного материала.

Фильтрат центрифугируют при 70—

100 g в течение 5 мин до образования конгломератов протопластов. Надосадоч

BA

NAA

MS 1 1 MS соли

Сахароза

Витамины В5

Фитогормоны

Зеатин 1 мг

Источники витамина В5

Миоинозитол 100 r

Тиамин HCl 1О r

Никотиновая кислота 1 г ,Пиродоксин НС1 1 r

Промывочный состав

MS соли 0,43 r

Сахароза 171,2 r

PVP — 40 40,0 r

MS соли поступают в виде предварительной смеси в виде сухого порошка.

Пример 9, Растения петуньи

Митчелла выращивают в камерах роста с двумя или тремя группами флуоресцентных ламп и двумя группами ламп накаливания (около 5000 лк). Температуру поддерживают постоянной при 21 С и освещают растения в течение

12 ч в день. Растения выращивают в смеси 50/50 вермикулита и PM о смеси.

Растения поливают раз в день питательным раствором Хогланда, Ткани берут с темно-зеленых растений с компактным кустистым ростом. Листья стерилизуют в растворе 10%-ной коммерческой хлорной извести и небольшого количества детергента Tween 20 в течение 20 мин с периодическим помешиванием. Листья смачивают, два или три раза-в дистиллированной воде. Из листьев вырезают тонкие полоски (около

1 мм) перпендикулярно основной жилке.

Полоски помещают в смесь ферментов, взятых в отношении около 1 r ткани на 10 мл ферментов. Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют в темноте или в слабом рассеянном свете при этом непрерывно осторожно пере†мешивают (около 40 об/мин) на ротор-: ном шейкере. Инкубирование с ферментами обычно проводят в течение ночи, т.е. около 16-20 ч, 19

1582990 ную жидкость декантируют и хлопья осторожно повторно суспендируют в промывочном растворе. Эту суспензию выпивают в склянки Бэбкока. Склянки заполняют на 2-3 см над основанием гор5 лышка. 1 мл растительной среды MS9 осторожно помещают слоем поверх про.мывочного раствора.

Склянки Бэбкока сбалансируют и .цен-1О трифугируют при 500-1000 об/мин в течение 10-20 мин, Протопласты образуют компактную полоску в горлышке у поверхности раздела. Эту полоску извлекают пипеткой, приняв предосторожности, чтобы не прихватить излишек раствора. Протопласты разбавляют MS9, В этот момент протопласты промывают М89 или разбавляют для культивирования без промывки.

Пр о топл а с ты с у сп е ндир уют в М$9 среде до 5 х 10 на мл и помещают в

Т-75 колбы по 6 мл в колбу, Колбу инкубир уют на уров не поверхности при слабом рассеянном свете или в темно- 25 те при 26-28 С. На третий день после удаления ферментов из тканей листа в каждую колбу добавляют MSO (среду, которая не содержала маннитола), используя количество, равное половйне исходного объема. То же к:оличество среды MSO добавляют снова на 4 день.

Это снижает концентрацию маннитола до около 0,33 M после первого разбав,пения и до около 0,25 М после второго разбавления, Пример 10, На пятый день после выделения протопласта, пяти-семидневные табачные суспензионные культуры табака (TXD клетки) разбавляют при необходимости MS2C средой до тачки, когда 1 мл легко распределяется по поверхности агарной среды в 100 х 15 мм чашках Петри, т.е. до

10-15Х суспензии (вес/объем). Агар- 45 ную среду получают, смешивая 0,8Zный агар со средой MS-ES,, обрабатывая смесь в автоклаве и охлаждая до тех пор, пока она не отвердилась в чашках. Один мл TXD суспензии распределяют на питательной среде (25 мл). 8,5 см диск ватманской фильтровальной бумаги кладут на ТХД клетки и разгла4 живают. 7 см диска той же бумаги кладут в центр большего диска.

Отдельно аликвотные части культуры клеток А, tumefaciens клеток добавляют в склянки, которые содержат растиs åëüíûå клетки. Один набор аликвотных частей содержит клетки с pMON 128

Ti коинтегративными плазмидами, содер> жащими химерические NÎS-NPT II-NOS re. гены, Другой набор аликвотных частей содержит клетки с pMON 120: Ti коинтегративными;плаэмидами, которые не содержат химерический NOS-APT II-NOS ген.

Бактерии добавляют в склянки при плотности 10 клеток/мл. 0 5 мл сме8 си клеток распределяют в тонком слое на поверхности 7 см диска фильтроваль ной бумаги, Затем пластины герметиэируют паропленкой или в пластиковых пакетах и инкубируют при прямом флуоресцентном освещении не более чем по

5 пластин в стопке, Через 7 дней колонии стали разли- . чимы. Через 14 дней 7 см диски с прилипшими к ним колониями переносят на новую МБО агарозную среду (без питающих клеток), содержащую 500 мкг/мл карбенициллина, а также 50 мкг/мл канамицинсульфата. Через две недели наблюдают интенсивно растущие зеленые колонии на пластинах, которые содер— жат растительные клетки, совместно культивированные с А. tumefaciens штаммаьж, содержащими коинтегратив ную NOS-NPT II плаэмиду рМ011 128, На пластинах не наблюдают трансформиро " ванные колонии, которые содержат растительные клетки, совместно культивированные с А. tumefaciens штаммами

9 содержащими коинтегративную плаэмиду, pMON 120, Канамицинустойчивые транс- форманты сохраняют рост в культураль ной среде, содержащей канамицин. Экс перименты Саузерна подтверждают, что эти клетки содержат химерический NOSNPT II ген.

Оба набора трансформированных клеток (и третий набор клеток, которые были трансформированы таким же способом химерическим геном, кодирующим фермент ИРТ типа 1), исследуют на устойчивость к канамицину.

Пример 11, Трансформированные канамицинустойчивые колонии содержат как опухолевые, так и неопухолевые клетки, Отделяют неопухолевые трансформированные клетки от опухолевых трансформированных клеток и осуществляют регенерацию дифференцированных растительных тканей из неопухолевых клеток, I 1

Колонии выращивают на МБ 104 агароэной среде, содержащей 30 мкг/мл

22

1582990

Формула изобретения

Составитель

Редактор В. Середа Техред Л.Олийнык

Корректор О. Кравцова

Заказ 2099 Тираж 494 Подписное

РчИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 канамицинсульфата и 500 мкг/мп карбенициллина, до тех пор пока они не достигают около 1 см в диаметре, Опухолевые колонии, которые имеют не5 сколько более бледный оттенок зеленого и являются более рыхлыми нежели неопухолевые колонии, удаляют из

MS 104 среды и помещают на М$11 среду, содержащую 30 мкг/мл канамицина и 500 мкг/мл карбенициллина. По мере роста колоний те из них, которые были бледно-зелеными и имели рыхлую структуру, удаляют и выбрасывают.

МЯ11 среда, содержит зеатин, фитогормон, который вызывает спонтанное образование ростков в неопухолевых ко-, лониях. Обнаруживают несколько ростков, развивающихся из канамицинустой- 20 чивых колоний, Эти ростки выращивают до нужного размера и срезают острым лезвием, а затем вводят в агароэную среду без фитогормонов, например MSQ, где они могли развить корни. При же †. 25 лании среду дополняют нафталинуксусной кислотой для того, чтобы вызвать образование корней. Растения выращивают до нужного размера в агарозной

° среде, а затем переносят в почву. При 30 правильном уходе растения растут до зрелости и дают семена, Способ получения трансформированных клеток двудольных растений путем совместного культивирования раститель ной клетки и бактерий Agrobacterium

tumefaciens, о, т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода нормальных трансформированных растительных клеток, конструируют плазмиду рМРБ 128 путем включения в вектор

pM0N 120 гена устойчивости к антибиотикам, вносят полученную плазмиду в штамм бактерий Agrobacterium tumefaсхепв GV 3111-С58 С1/pTi В65

3ф конъюгацией трех штаммов бактерий

Escherichia coli/рМОИ 128, Escherichia coli НВ 101 pRK 2013 и Agrobacterium tumefaciens CV 3111, отбирают штамм бактерий А. tumefaciens с ксан" тегративной плаэмидой pMON 128:pTi

В65 3 tra на селективной среде, содержащей ?5 мкг/мп хлорамфеникола и по 100 мкг/мп спектиномицина и стрептомидина, ген устойчивости к антибиотикам вводят в растительные клетки в результате совместного культивирования протопластов с бактериями А. tumefaciens, содержащими коинтегративную плазмиду, и отбирают трансформированные растительные клетки на селективной среде, содержащей соответствующий антибиотик, l