Рекомбинантная плазмидная днк р7,5s @ - s, кодирующая pres @ - s ген вируса гепатита в, способ ее конструирования и штамм рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующий pres @ - s ген вируса гепатита в
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может найти применение при получении субъединичной или живой вакцины против гепатита В (ВГВ), а такт же при разработке днагностикума на ргеЯ2 антиген, Рекомбинпнтнач пляэ- ДНК р г,5 S2- P состоит из фрагмента генома ВГВ, и вектора, обеспечивающего встройку и экспрессию генноинженерных субстанций в ДНК вируса осповакцины (ВОВ). качестве фрагмента генома ВГВ используют фрагмент ДНК длиной 1403 п.о,, коди- pyiot UfH S ген за исключением 1-3 N-концевыхаминокислот prcS - области, а также синтетический фрагмент ДНК, кодирующий 1-3 аминокислоты preSj-области и эффективный сайтинициации трансляции, В качестве вектора для встройки вышеописанных генноинженерных субстанций в ДНК ВОВ используют плазмиду pVAR 15, обеспечивающую интеграцию и экспрессию preSa S гена в составе гена тнмидннкиназы ВОВ, Рекомбинаитнмй вирус оспопакцины, полученный на основе вышеуказанных компонентов, экспрессирует и HBR антигены, при этом .prp.R -области не приводит к снижению уровня экспрессии S-компонеита, Ю СП 1 :л :л 1 sr
* ь
СОВХОЗ СОЭЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (51) 5 (;17. V, l5/00, A ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬП ИЩд ПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИ ИЗОБРКтния Н АВТОРСКОМ Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ j (56) Авторское свидетельство СССР 1354709, кл A 61 К 39/29ь 1985 ° (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК р7,5S - S,КОДИРУ10ЩАЯ preSz- $ ГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА В, СПОСОБ FF. КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА ОСПОВАКЦИН111ьЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ preSà-S ГЕH ВИРУСА ГЕПАТИТА- В (57) Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может найти применение при получении субъединичной или живой вакцины против гепатита В (ВГВ), а так-. (46) 07,07.93. Бюл. 1" 25 (21) 4445111/13 (22) ?0,06,88 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) А.С,Беляев, H,И.Путинцева, И.П.Дмитриев, А.Д.Аммосов, H,H,×eðíûé, F..Á.Ìèðîíîâà, М.IÎ.ÐóêàâèííèêoB, Л,Н.Семенова, В.В,Самуков, A,Н.Сабиров, Г.A.Мезенкб, Н.M.Микрюков,,В,А.Рябинин, A:H.Синяков и lO,Í,Çàðâèíà Изобретение относятся к биотехно.логии, в частности к генетической инженерии и медицине, и представляет собой рекомбинантный штамм вируса осповакцины, предназначенный для. разработки живой илн субъединичной вакцины против гепатита Вь а также диагностикума íà preS< область поверхностного антигена вируса гепатита В. Целью объектов изобретения является создание штамма рекомбинантного же при разработке диагностикума на р ге Я антиген, Рекомбинаитная плазмиднал ДНК р г,5 S2 . состоит из Фрагмента генома ВГВ, и вектора, обеспечивающего встройку и экспрессию генноинженеркых субстанций в ЛНК вируса осповакцины (ВОВ) . В качестве фрагмента генома ВГВ используют фр агмент ДНК длиной 1403 н. о,, кодирующий рке8 — S ген за исключением 1- 3 N-концевых аминокислот р ге Б— области, а также синтетический й>parMeHt ДНК ° кодирующий 1 — 3 аминоки слоты preS области и эффективный сайт инициации трансляции. В качестве вектора для встройки вышеописанных генноинженерных субстанций в ДНК ВОВ используют плазмиду pVAR 15, обеспечивающую интеграцию и экспрессию preS> - S гена в составе гека тимидинкиназы ВОВ. Рекомбинантный вирус оспояакцины, полученный на основе вьпчеуказанных компонентов, экспрессирует preS z и НВБ антигены, при i, этом.рь:еЯ,-oблaсти не приводит к снижению уровня экспрессии S-компонента, вируса оспбвакцины, экспрессирующего рге8 -S ген вируса гепатита В в клетках млекопитающих с сохранением уровня экспрессии Б-компонента, Сконструирована ре комбин антная плаэмндная ДНК р7,58 -S, кодирующая синтез полипептиднои субстанции для вакпины против гепатита В и состоящий из: 4рагмента генома вируса гепатита В, кодирующего ргеБ -S белок; 3 575576 4 синтетического фрагмента ДНК, содержащего сайт эффективной инициации трансляции; плазмидного вектора, обеспечивающего встраивание и экспрессию чужеродных генов в гене тимидинкиназы виру- . са осповакцины. В качестве фрагмента генома вируса гепатита B(ayw) используют фрагмент ДНК длиной 1403 п.o., кодирующий. ргеБ -S ген (за исключением 1-3 .а,к,, расположенных на М«конце preS<-S-области). В качестве эффективного сайта ини- 5 циации тр"":íñëÿöèè используется синтетический фрагмент ДНК длиной 17 п,о., кодируяций также 1-3 а;к. preS -области и имеющий структуру, 20 2 reSg 5-ААТТАСАТСТАТСАТСААСТСС-3 3-TCTAGATAGTACTTGACCTTAA-5 EcoR1 CgL 1 1 EcoRl 45 В качестве плаэмидного вектора, обеспечиваняцего встраивание чужеродных генов в ген тимидинкииазы вируса 3р осповакцины и их экспрессию под контролем сильного 7,5к промотора вируса осповакцины используют плазмиду pVAR15. Сущность изобретения заключается в том, что для получения ргеЯ -S полипептида методом направленного мутаге-. йеза в preS<»S-ген вводят EcoRl-сайт на расстоянии 5 п.о. от ATG-кодона preSz-области, отрезают по EcoR1-сай- 4п ту АТС-кодон pxeS -области с окружающим его слабым природным сайтом инициации трансляции и заменяют его на сильный. У штаммон вируса гепатита В, имеющих пркродныи EcoR1-сайт в preS -области, замена сайта инициации трансляции может быть проведена без использования направленного мутагенеэа. Для достижения целя ргеЯ -Я ген с сильным сайтом инициации трансляции используют B комбинации c Bbltoe указанным ппазмндным вектором для получения рекомбинантного вируса осповакцины, содержащего ргеЯ -S ген под .контролем 7,5к промотора в составе фена тимидинкииазы вируса оспонакцины и экспрессирующего указанный ген. Штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Штамм обладает свойствами типичного представителя семейства ортопокснирусов. Вирионы штамма имеют размер 200х300 нм, характерную брикетообразную форму z» по данным электронной микроскопии не отличаются от исходного штамма ЛИВП. Физиолого-биохимическая характеристика и культуральные свойства штамма, ДНК штамма в 7,5S<-S имеют длину около 180 т,п,о., при этом вместо Hind IIIK-фрагмента штамма ЛИВП имеется фрагмент большой молекулярной массы, по данным ДНК-ЛНК бпот"гибридизации содержащий preS -S-ген вируса гепатита В. При размножении штамма на куриных эмбрионах характер поражений на хориоаллантоисных оболочках такой же, как и при.размножении штамма ЛИВП, Кроме того, штамм не отличается от штамма ЛИВЛ по продуктивности в монослое перениваемых линий клеток CU" 1, Rat-2, а также в монослое фибробластов эмбрионов кур. В отличие от штамма ЛИВП рекомбинант Ь 7,5Я ".S обладает tK-фенотипом, т,е. не способен к размножению на перениваемой линии клеток Rat-2 в присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина, Патогенность для животных, Исследование снойств штамма .b7,5Я -S на лабораторных животных ,показало, что в стандартных текстах на пирогенность, токсичность, некротическую активность рекомбинантный штамм b7 5S,"Я не отличается от ис ходного штамма ЛИВП, 1 Оснон»»»»м отличием штамма от ЛИВП является способность к синтезу preS u HBS антигенон при инфициронании культуры клеток СЧ-1, Штамм рекомбинантного вируса оспонакцины b7,5S -Я делон»»рован н Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.Д,И,Ивановского за номером ГКВ М 213-1. П р ц м е р 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК р7,5Я -S. В качестве источника ргеЯ, -Я ге- на вируса гепатита В использунт плазмиду pLiC1, содержащую Ва»оН1-фрагмент ДНК вируса гепатита Б субтипа ауи, 7 1575576 8 45 мин noeëå нанесения преципитата клетки покрывают 4,5 мл среды Игла . ДМЕМ с ЯХ эмбриональной сыворотки и инкубнруют нри 37 С 3,5 ч. После этого среду заменяют на свежую с . 8Х эмбриональной сыворотки и клетки инкубируют еще 18-24 ч, Урожай -вируса после трансфекции заморажнвают, оттаивают и раститровывают íà 10 ТК Rat-2 (ТК ) клетках в присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина под агаровым покрытием. Через 48 ч-инкубацин наносят второе покрытие с 0,002 красителя нейтрапьйого красно ro Вирусы, полученные нз отдельных блниек, подращивают в 24-луночных пластиковых платах и анализируют методом ДНК-ДНК,dot-гибридизации на наличке чужеродной ДНК, Положитель- 20 mm no гибридизации клоны дважды клонируют и анализируют экспрессию генЬв вируса гепатита В s составе ДНК рекомбинантных вирусов осповакцины. С этой целью монослой линии CV-1 25 клеток в 24-луночных платах инфици.. руют рекомбинантным вирусом осповакцины с множественностью 20 БОЕ/кл, проводят адсорбцию вируса при 37 С 1 ч, после чего. удаляют неадсорбиро.". 30 ванный вирус, монослой промывают средой Игла ДМЕМ, после чего в каждую лунку добавляют по 1 мп среды Игла БИЕМ с 2Х эмбриональной сыворотки. Зараженные клетки никубируют 24 ч при 35 32 С в присутствии 5Х СО . Культурааьную жидкость отбирают в пробирки и передают на тестирование экспрессии антигенов вируса гепатита В. Оставииеся клетки заливают 1 мл среды - 40 Игла ДИЕИ, двухкратно заморажнвают и-оттаивают обрабатывают ультразвуком, передают на тестирование экспрессии. Определение количества HBBAg в 45 лнзатах инфицированных клеток и культуральных жидкостях проводят твердо4аэным иммунорадиометрическим методом, Схема анализа включает 3 стадии: во-первых, сорбцию антител к HBSAg 50 на носителе; во-вторых, связывание антигена с закрепленными антителами прн инкубации пробы с носителем и, 9 третьих, проявление связавшегося а 55 йодом-125 иммуноглобулинами против HBSAg. Для анализа используют полистирольные планшеты для и мунологических реакций. (Ленинградский завод медпрепаратов) . Таким образом твердофазным носителем служат стенки лунок планшета. Для сорбции антител в каждую лунку планщеты наносят по 30 мкл раствора иммуноглобулинов против HBSAg c концентрацией 0,02 мг/мл в 0,02 М натрийфосфатном буфере рН 7,8 н инкубируют при комнатной =емпературе в течение 2-3 ч, Лунки промывают 3 раза забуференным физиологическим раствором (ЗФР) — 0,15 М NaC1 в 0 02 M натрийфосфатном буфере рН 7,5, С целью снижения неспецифической сорбции белков лунки обрабатывают 0,4Х раствором БСА (бычий сывороточный аль. бумин) в ЗФР в течение 20-30 мин, Пробы для анализа HBSAg или образцы стандартного раствора НВ Ао объеиэм 30 мкл, с добавлением 0,1Х три" тона Х-100 инкубируют в течение ночи, отбирают, лунки промывают ЗФР и наносят по 25 мкл раствора меченого иммуноглобулина против HBSAg общей радиоактивностью по 100-. 150 тыс.имп/мин на лунку. Раствор меченых антител в ЗФР содержит БСА и . тритон Х-100.Планшетку с раствором метки инкубируют 4-5 ч,про!ывают лунки вырезают раскаленной проволокой И их радиоактивность считают иа )-счетчике С-9000, 1 Оба варианта рекомбинантных ви, русов осповакцины н b7 5S -S . и ! ф В g b7,5S - синтезируют около 300-500 нг . HBSAg в пересчете на 10 инфицированных клеток. Таким образом получен рекомбинантный вирус осповакцины, обеспечивающий экспрессию preS -S гена вируса гепатита В в клетках млекопитающих с сохранением уровня экспрессии S-компонента. Полученный штамм может быть использован для разработки живой или субъединичной вакцины против гепатита В (в настоящее время считается общепринятым, что полноценная вакцина против т:елатита В должна основываться на рге8 -S белке HBSAg) а также для разработки диагностикума, позволяющего идентифицировать не только анти-HBSAg антитела, но и антитела иа preS -компонент 2 Формула изобретения 1. Реко бинантная аз,,лн,„г!Нк Р7i5S@-S, кодируюшая preS, -$ ген виру i576 встройки олигоиуклеотид» георетическо6 . проверяют методом Ма к с ама- Гилб ер та, Полученная плазмидя обозначена UCI83Б„-S. Для подстановки ргеБ —.Б гена под контроль 7,5к промотора вируса осповакцины и окружения его участками гена тимидинкиназы, BgIII-ÂamH I фраг t0 мент, содержащий ргеБ -Б геп, выде" из плазмиды pUCIЯЗБ -Б H клoнируют по BamHI-сайту в векторе pUAP15, Среди клоновр содержащих встроенный BglII-ВашНI фрагмент, отбирают клон 15 с правильной ориентацией preS<- гена относительно 7,5к промотора с помощью рестрикционного анализа со 1 а также BamHI и ХЪа1-рестриктаэами. Полученная таким образом целевая 20 плазмида обозначена р7,5S -S, lI р и м е р 2, Получение реком;бинантных вирусов осповакцины. 5-AGTGGAATTC САСАА-3 55.Р 157 50 мкт ДНК иназмиды р1,С! расщеилячт ВашН1-эндоиуллеазой. Фрагмент ЛНК вируса гепатита 8 выделяют методом злектрофореэа в агароэном геле с последующей;электроэлюцией на диализну мембрану и лигируЫт в стандартных условиях с линейной формой ДНК фага И13мр19, полученной после обра- ботки рестриктазой BamHI. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е.со1 8MH71"18 н в клонах, содержащих RF-форму ДНК фаза со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью рестрикционного аналиsa Xbal, а также Xbal и Есой1.-рестриктаэами, ДНК полученного рекомбинантного фага MI319S "S подвергают олигонуклеотид " направленному мутагенезу с использованием следующего олигонуклеотида При этом происходит замена нуклеотидного остатка Т на С в положении +11 preh<-области, что приводит к образованию EcoRI-сайта рестрикции. BamHI-фрагмент ДНК вируса геп.атита В, н который введен ЕсоР I-свйт, переклонируют в плазмиде pUC18, В ДНК полученной плаэмиды ЬОС181Б -S приводят замещение ЕсоК1-фрагмента, содержащего АТС-кодон preS -области и слабый сайт инициации трансляции на синтетический EcoRI - EcoRI 22 -членФ ный олигонуклеотйд укаэанного состава, содержащий сильный сайт. инициации трансляции С этой целью 0,5 нМ ДНК плаэмиды pUCI 8 IS обрабатывают в стандартных условиях EcoR I -рестриктаэой и лигируют с 20 нИ указанного олигонуклеотидв. Полученной лигазной смесью трансформируют компонентные клетки E.coli НВIО!. Apr-трансформанты анализируют на наличие встроенного фрвгмента.с помощью гибридизации Ы вд1ц бактериальных колоний нв нитроцеллюлоэных фильтрах с ме" чеными Р"зондами, полученными на 2 основе исходных олигонуклеотидов. ДНК клоков, отобранных с помощью гибридизации, анализируют ориентаций встроенного олигонуклеотида с помощью EcoRI u ХЬв1 эндонуклеаз рестрикции. Соответствие первичной последовательности плазмидной ДНК в месте Для сравнения с традиционным вариантом рекомбинантной ДНК, исполь" зуемым дяя экспрессии Б-гена вируса гепатита В в составе генома рекомбинантних вирусов осповакцины, сконструирована плазмида p7,5S. Плаэмиду р7,5S получают путем клонирования ХЬа1-ВапН! фрагмента ДНК вируса гепатита В, содержащего S-ген без ргеБ -последовательности, по BamHIсайту вектора рЧАР15„ При этом происходит подстановка S-гена под контроль 7,5к промотора и введение его s состав ТК-гена, Таким образом плазмида р7,5S аналогична известным. . Введение и ркеБ -S генов вируса гепатита В в состав гена тимидннкиназы вируса осповакцины осуществляют общепринятым методом котрансфекции плазмидной ДНК перевиваемой линии CV-1 клеток, инфицированных вирусом осповакцины. Кубарики с монослоем перевиваемой линии клеток почек зеленой мартышки линии СЧ-1 заражают вирусом осповакцины штамм ЛИВЛ с множественностью 0 05-.0,1 HOE/êë.Àäcoðáöèþ проводят при 37 С 1 ч, затем удаляют неадсорбированный вирус и клетки покрывают поддерживающей средой (Игла ДИКИ с 2Х эмбриональной сиворотки). Через I ч инкубации при 37 С поддерживающую среду сливают и на клетки наносят по 0,5 мл на кубврик преципитвта ДНК рекомбинвнтной плазмиды и ДНК внруса осповакцины ЛИВП и инкубируют при комнатной температуре. Через 576 ргеБ Г 5-AATTAGATCTATCATGAACTGG-3 3 -TCTAGATAGTACTTGACCTTAA-5 RcoR1 BgeII EcoR!! 5 "ААТТАСАТСТАТСАТСЛЛСТСС-3! Э - TCTAGATAGTACTTGAC CTTAA-5 Составитель Т.Забойкина Редактор JI. Герасимова Техред M. Ходанич Коррект; р .3,.110 c: i :. Заказ 2832 Тираж Подписное BHHHIiIt Государственного комитета по изобретениям и открытиям пр . 1::." 1 1130.}5, Москва, Ж-35, Раулская наб., д. 4/5 Производстве ««0-113ilaT03lb(К«А K0HOH«at "Пате!1T, г. Ужгo()0.",,, 33. 1,:; . Ц l 575 ся гепатита В, мол.мас.З,б Md и раз" нером 5755 и, о., содержащая: BamH1-EcoRl-фрагмент ДНК вируса гепатита В размером 1403 п„о., кодирующий рге -S ген за исключением ° 1-3 а.к,, расположенных на 11-конце preS -области; FrnRI-ВрП1-синтетический фрагмент ДНК размером 17 п.о., имеющий структуру и, кодирующий 1-3 М-концевые аминокис" 20 лоты ртеЯ -области, а также сайт инициации трансляции; BamH1-ВапНI-фрагмент вектора pVAP I5 размером 4330 п.о. с нуклеотидной последовательностью гена тими" ,динкиназы вируса осповакцины с встроV енным в нее 7,5к промотором вируса осговакцины; генетические маркеры; bia — ген ампициллинрезистентности — ген Р -лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации F..coli; tk — прерванный ген тимидинкиназы вируса осповакцинл1, обуславливающий 35 ТК -фенотип при трансформации ТК вируса осповакцины; уникальные сайты рестрикции: HindIII- carr между последовательностью ДНК плазмиды pBR 322 и 40 ИО с31!3до вател ьно стью ге!1:1 1 1 «1дн пкпн 3I эы вируса ос1к3вякц11н11, P s t l-с айт в гене ампиц31ллннре з и<-тентности1 ВапН1-сайт л1еждч поспедо11яте31ьностью ДИК вируса гепатита В и последовательностью геня тимидинкиназы вируса осповакцины, 2. Способ конструирования рекомби-, .нантной плазмндиой ДИК 137,58, -8, э а к л ю ч а ю шийся в том, что ВапН 1-фрагмент ДНК, содержящпй ргеЯ -ген фируса гепатита В, клонируют в векторе ИIЗмр 19, ме1одом о31нгонуклеотид - направленного мутaãåèåза вводят EcoRI - сайт путем замены нуклеотида Т на С в +II положении preSe-области, BamHl."ôðaгмент ДИК вируса гепатита В с введелпп1м в preS<-область EcoRI "сайтом, . переклонируют в векторе pUCIR и производят замещение EcoRI-фрагмента ДНК, со" держащего ATG"êoäoí ргеЯ -области ня синтетический FcoRI-фрагмент ДИК выделяют BgiII-BamHI-фрагмент ЛИК, содержащий ргеЯ "S геп с замеще33и«1м сяйтом инициации трансляции, и кпо" пируют его no BarilH I-сайту и векторе pVAP 15, 3. Итамм вируса осповакпн3«,1 ГКВ N 2131, экспрессирующий preS -$ гсн 2. вируса гепатита В.
